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1996年，馬伊琍與保劍峰、陳龍、高曙光、張雅(ya)琳(lin)共同出演了電(dian)視劇《真(zhen)空愛情記錄》，講述了一群大學畢業生為了工(gong)作和(he)愛情奮斗的故(gu)事(shi)。

1998年，馬(ma)伊琍畢(bi)業(ye)于上海戲劇學院，畢(bi)業(ye)后參(can)演了第一(yi)部改編自(zi)陜西駐滬作家(jia)李春平同名小(xiao)說的電影《玻璃是透明的》，飾演“小(xiao)丫子”。同年，其出(chu)演了第一(yi)部古(gu)裝(zhuang)電影《孔乙己》。

2000年，通過出演《黑(hei)洞》提(ti)升了表演事業。同年，在(zai)電(dian)視劇《前世今生》中(zhong)飾演美貌且氣質(zhi)超凡的(de)秦(qin)婉瑩。

2001年(nian)，出演(yan)(yan)電(dian)視劇《白(bai)天睡覺的女人(ren)》中的李秀。同(tong)年(nian)，在電(dian)影(ying)(ying)《西施(shi)眼》中飾演(yan)(yan)施(shi)雨，該片在2002年(nian)美國(guo)夏(xia)威夷國(guo)際電(dian)影(ying)(ying)節(jie)中獲評(ping)審(shen)團大將及亞(ya)洲最佳電(dian)影(ying)(ying)。

2002年，因出演電視劇《還(huan)珠格格Ⅲ之天上人間(jian)》中(zhong)的(de)紫(zi)薇一角(jiao)而被大眾所熟知。

2004年(nian)，出演了(le)由(you)黃磊指導的《天一(yi)生水(shui)》，在劇(ju)中飾演一(yi)個混血姑(gu)娘明妮。

2005年，在張黎導演的電視(shi)劇《錦(jin)衣衛》中出演了傾國美人客印(yin)月(yue)。

2006年，參演(yan)的(de)(de)《喬家大院》在央視熱播，其扮演(yan)的(de)(de)“江雪瑛”收獲了更多的(de)(de)觀眾和(he)粉絲。

2007年，因出演由趙寶(bao)剛(gang)指(zhi)導的青春勵志(zhi)電視(shi)劇(ju)《奮斗》而名聲驟起，同年6月底，馬(ma)伊琍簽約了(le)內地影視(shi)巨擎(qing)橙天娛樂。

2008年(nian)，因(yin)拍攝電視劇《為誰心(xin)動(dong)》無(wu)悔剃光了(le)頭。同年(nian)，其(qi)憑(ping)借影片《江北好人(ren)》，戰勝了(le)李冰冰、范冰冰兩位候選人(ren)，成(cheng)為了(le)長春電影節影后。

2009年，馬伊琍與佟大(da)為共同出(chu)(chu)演了(le)電視(shi)劇(ju)《婚姻保衛戰(zhan)》。同年，出(chu)(chu)演的首部(bu)反映豫(yu)商故事的電視(shi)劇(ju)《經緯天地》在CCTV-8播出(chu)(chu)，這也是她繼《喬家大(da)院(yuan)》之后首次登陸央(yang)視(shi)，劇(ju)中(zhong)扮(ban)演尚(shang)達志的妻子順(shun)兒(er)。

2010年，與涂松(song)巖合作(zuo)主演(yan)都市題材電視劇(ju)《雙城生(sheng)活》，她在劇(ju)中塑(su)造(zao)的北京(jing)(jing)大(da)妞郝京(jing)(jing)妮，受(shou)到了網友(you)的普遍好評。憑(ping)借(jie)該劇(ju)，馬伊琍獲得國劇(ju)盛典2011年度最(zui)佳女演(yan)員(yuan)。

2013年年初，馬伊琍與杜(du)淳、劉莉(li)莉(li)、陳思斯等合作(zuo)出演(yan)電視劇《青春期撞(zhuang)上更年期2》，此(ci)外，還客串了電影《不二神探》，并且徹底顛覆以往的形象痛罵文章，成(cheng)為了影片一大看點。

2013年(nian)，首當制片人的(de)馬伊琍與首次當導演的(de)丈夫文章(zhang)合作了電視(shi)劇《小(xiao)爸爸》。

2015年，出演了公路(lu)(lu)犯罪片《未擇之路(lu)(lu)》。11月7日，在電視劇(ju)《北上廣不相信眼淚》中飾演潘蕓，憑(ping)該劇(ju)獲得第19屆(jie)華鼎(ding)獎(jiang)中國(guo)百強電視劇(ju)最佳女主角。

2016年9月(yue)，與(yu)陳建(jian)(jian)斌合作主演(yan)都市幽默(mo)劇《中國式關系》，飾演(yan)美女(nv)建(jian)(jian)筑設計(ji)師江一楠。

2017年(nian)，主演(yan)(yan)文章執導的諜戰劇《剃刀邊(bian)緣》，劇中(zhong)飾(shi)(shi)演(yan)(yan)關(guan)海丹(dan)。同年(nian)參演(yan)(yan)《建軍(jun)大業》，飾(shi)(shi)演(yan)(yan)向(xiang)警予角色。