黃(huang)熱病(bing)(bing)毒(du)屬(shu)(1qav/virus)包含80多個成員，屬(shu)于正(zheng)鏈RNA病(bing)(bing)毒(du)，其(qi)(qi)中半數以上的(de)病(bing)(bing)毒(du)能夠誘發人和動物產生疾病(bing)(bing)，患病(bing)(bing)率(lv)高(gao)而治(zhi)愈率(lv)低(di)，容易留下一些嚴重的(de)后遺癥，給人類健康(kang)帶來(lai)很大威脅，如流行性(xing)乙型(xing)腦炎病(bing)(bing)毒(du)(JEV)、登革熱病(bing)(bing)病(bing)(bing)毒(du)(DEN)、黃(huang)熱病(bing)(bing)毒(du)(YFV)、蜱傳腦炎病(bing)(bing)毒(du)(TBEV)等。一直以來(lai)人們對RNA病(bing)(bing)毒(du)的(de)了解都(dou)比(bi)較缺(que)乏，無論是分子水平(ping)上的(de)機(ji)理(li)研究，還(huan)是宏(hong)觀上疫苗的(de)研制、藥物的(de)開(kai)發，其(qi)(qi)進展都(dou)非常緩慢。
嵌(qian)(qian)(qian)合(he)病(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)是一(yi)種基(ji)因工程重組病(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)，在(zai)(zai)(zai)制備技術上并(bing)不(bu)存在(zai)(zai)(zai)太大問題，但作(zuo)為(wei)重組病(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)，在(zai)(zai)(zai)安全性上還有(you)(you)一(yi)定的(de)(de)風(feng)險，在(zai)(zai)(zai)自然(ran)條件下，有(you)(you)病(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)之間自發產生(sheng)重組的(de)(de)例子，可能獲得一(yi)些意想不(bu)到的(de)(de)新型(xing)病(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)，比母體(ti)株(zhu)毒(du)(du)力更(geng)強，對生(sheng)物體(ti)更(geng)具有(you)(you)威(wei)脅性。所(suo)以在(zai)(zai)(zai)制備嵌(qian)(qian)(qian)合(he)病(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)時，要采用已知特(te)性的(de)(de)病(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)株(zhu)作(zuo)為(wei)嵌(qian)(qian)(qian)合(he)病(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)的(de)(de)骨(gu)架結構，特(te)別(bie)是多(duo)選用減毒(du)(du)株(zhu)作(zuo)為(wei)載(zai)體(ti)病(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)目(mu)前黃熱病(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)的(de)(de)嵌(qian)(qian)(qian)合(he)病(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)采用的(de)(de)載(zai)體(ti)主要有(you)(you)以下幾種。
YF一(yi)(yi)(yi)17DD 疫(yi)(yi)苗(miao)(miao)株(zhu)(zhu) YF一(yi)(yi)(yi)17DD是目前預防黃(huang)熱(re)病(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)感染的(de)(de)(de)(de)一(yi)(yi)(yi)株(zhu)(zhu)減(jian)毒(du)(du)(du)活(huo)疫(yi)(yi)苗(miao)(miao)】，始用于(yu)1936年(nian)(nian)，在(zai)過(guo)去的(de)(de)(de)(de)6O多年(nian)(nian)中，有超過(guo)3億人接(jie)種(zhong)過(guo)該(gai)疫(yi)(yi)苗(miao)(miao)，安全(quan)(quan)有效(xiao)。該(gai)疫(yi)(yi)苗(miao)(miao)株(zhu)(zhu)免疫(yi)(yi)原性(xing)(xing)很好，單劑量(liang)接(jie)種(zhong)后(hou)(hou)10d內，近lo0%的(de)(de)(de)(de)接(jie)種(zhong)者(zhe)產(chan)生中和(he)(he)抗(kang)體(ti)，免疫(yi)(yi)力(li)持久甚至能(neng)夠維持終身。將YF一(yi)(yi)(yi)17DD疫(yi)(yi)苗(miao)(miao)株(zhu)(zhu)和(he)(he)原病(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)株(zhu)(zhu)YF—Asibi進(jin)行序列比較后(hou)(hou)發現，該(gai)病(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)的(de)(de)(de)(de)抗(kang)原表(biao)位多集中在(zai)E基(ji)(ji)因，構(gou)建(jian)嵌(qian)(qian)(qian)合(he)(he)(he)(he)病(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)多以(yi)這一(yi)(yi)(yi)段(duan)基(ji)(ji)因作(zuo)(zuo)為(wei)(wei)靶基(ji)(ji)因。這樣構(gou)建(jian)的(de)(de)(de)(de)嵌(qian)(qian)(qian)合(he)(he)(he)(he)病(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)中，由YF一(yi)(yi)(yi)17DD株(zhu)(zhu)保(bao)留的(de)(de)(de)(de)NS蛋(dan)(dan)白基(ji)(ji)因只是誘發針對該(gai)蛋(dan)(dan)白的(de)(de)(de)(de)CTLs和(he)(he)非(fei)中和(he)(he)性(xing)(xing)抗(kang)體(ti)，而不具有交叉保(bao)護性(xing)(xing)，所以(yi)嵌(qian)(qian)(qian)合(he)(he)(he)(he)病(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)作(zuo)(zuo)為(wei)(wei)疫(yi)(yi)苗(miao)(miao)使(shi)用時(shi)不會引起一(yi)(yi)(yi)般重組病(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)帶來的(de)(de)(de)(de)抗(kang)載(zai)體(ti)免疫(yi)(yi)反應，即使(shi)曾經接(jie)種(zhong)過(guo)YF一(yi)(yi)(yi)17DD的(de)(de)(de)(de)接(jie)痘者(zhe)再(zai)接(jie)種(zhong)嵌(qian)(qian)(qian)合(he)(he)(he)(he)病(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)也是安全(quan)(quan)有效(xiao)的(de)(de)(de)(de)，可以(yi)作(zuo)(zuo)為(wei)(wei)一(yi)(yi)(yi)個理想的(de)(de)(de)(de)活(huo)疫(yi)(yi)苗(miao)(miao)株(zhu)(zhu)嵌(qian)(qian)(qian)合(he)(he)(he)(he)病(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)載(zai)體(ti)。1989年(nian)(nian)Rice等151構(gou)建(jian)了(le)YF一(yi)(yi)(yi)17DD的(de)(de)(de)(de)感染性(xing)(xing)克隆(long)，為(wei)(wei)構(gou)建(jian)嵌(qian)(qian)(qian)合(he)(he)(he)(he)病(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)提供了(le)方便，目前文獻中報道的(de)(de)(de)(de)有關黃(huang)熱(re)病(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)嵌(qian)(qian)(qian)合(he)(he)(he)(he)株(zhu)(zhu)多以(yi)此病(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)株(zhu)(zhu)作(zuo)(zuo)為(wei)(wei)載(zai)體(ti)病(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)。已(yi)經成功構(gou)建(jian)了(le)包(bao)括JEV、TBE、WNV、DEN等4個血清型(xing)病(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)的(de)(de)(de)(de)嵌(qian)(qian)(qian)合(he)(he)(he)(he)體(ti)。
YF一17DD 疫苗(miao)株
DEN一(yi)(yi)4變(bian)(bian)異株 登革病(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)(du)分為4個(ge)血(xue)清型，這(zhe)4型病(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)(du)結(jie)(jie)構(gou)(gou)蛋白氨(an)基(ji)酸序列(lie)同源性(xing)高達62%-74%，并且(qie)它們(men)(men)之間還(huan)有(you)很好的(de)交(jiao)叉免疫原(yuan)(yuan)性(xing)，一(yi)(yi)直以(yi)來(lai)，人們(men)(men)試(shi)圖構(gou)(gou)建登革病(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)(du)的(de)4價疫苗，Bray等從1991年開(kai)始登革病(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)(du)嵌合(he)病(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)(du)的(de)研(yan)究，以(yi)DEN一(yi)(yi)4814669株全長克隆作(zuo)(zuo)為載體(ti)(ti)，構(gou)(gou)建了(le)(le)包(bao)括DEN—l到(dao)(dao)DEN一(yi)(yi)3的(de)嵌合(he)病(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)(du)，結(jie)(jie)果發現幾株病(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)(du)的(de)毒(du)(du)(du)(du)性(xing)并沒(mei)有(you)太(tai)大改(gai)(gai)變(bian)(bian)，他(ta)們(men)(men)認為若(ruo)能夠(gou)以(yi)一(yi)(yi)個(ge)毒(du)(du)(du)(du)性(xing)低的(de)DEN-4病(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)(du)作(zuo)(zuo)為載體(ti)(ti)骨架，可能會使嵌合(he)病(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)(du)毒(du)(du)(du)(du)性(xing)下降，由于3端(duan)和5端(duan)非編碼(ma)區(qu)在病(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)(du)的(de)復(fu)制中(zhong)可能也(ye)起(qi)到(dao)(dao)調控作(zuo)(zuo)用(yong)，他(ta)們(men)(men)在構(gou)(gou)建的(de)DEN一(yi)(yi)4感染性(xing)克隆的(de)基(ji)礎上，刪(shan)除其3端(duan)和5端(duan)非編碼(ma)區(qu)的(de)部分序列(lie)，結(jie)(jie)果篩(shai)選到(dao)(dao)一(yi)(yi)株減毒(du)(du)(du)(du)株，其3端(duan)去掉了(le)(le)3O個(ge)核苷酸，毒(du)(du)(du)(du)性(xing)降低但是免疫原(yuan)(yuan)性(xing)并沒(mei)有(you)改(gai)(gai)變(bian)(bian)。用(yong)這(zhe)個(ge)減毒(du)(du)(du)(du)株作(zuo)(zuo)為載體(ti)(ti)和其它3個(ge)血(xue)清型的(de)登革病(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)(du)構(gou)(gou)成嵌合(he)病(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)(du)后，果然(ran)有(you)效地降低了(le)(le)病(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)(du)毒(du)(du)(du)(du)性(xing)；其后這(zhe)個(ge)載體(ti)(ti)也(ye)用(yong)于構(gou)(gou)建黃熱病(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)(du)屬其他(ta)成員(yuan)的(de)嵌合(he)病(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)(du)。
DEN一(yi)4變異株
DEN一(yi)(yi)2 PDK一(yi)(yi)53減(jian)毒(du)(du)(du)(du)株(zhu) 該(gai)(gai)減(jian)毒(du)(du)(du)(du)株(zhu)也主(zhu)要(yao)是用于(yu)合(he)成登(deng)革病毒(du)(du)(du)(du)的(de)嵌合(he)疫(yi)苗，2O世紀8O年(nian)代(dai)初期，泰(tai)國Mahidol實驗室將4種血(xue)清型的(de)登(deng)革病毒(du)(du)(du)(du)經(jing)過在(zai)細(xi)胞(bao)傳(chuan)代(dai)中后獲得(de)各自的(de)減(jian)毒(du)(du)(du)(du)株(zhu)，其中以DEN一(yi)(yi)2PDK一(yi)(yi)53減(jian)毒(du)(du)(du)(du)株(zhu)減(jian)毒(du)(du)(du)(du)效果最(zui)好，免疫(yi)保護力最(zui)強最(zui)持久。將該(gai)(gai)減(jian)毒(du)(du)(du)(du)株(zhu)和(he)(he)(he)野生株(zhu)進(jin)行比較(jiao)，發現核苷酸(suan)水平上的(de)變異主(zhu)要(yao)在(zai)非結(jie)構區，說(shuo)明該(gai)(gai)病毒(du)(du)(du)(du)株(zhu)和(he)(he)(he)毒(du)(du)(du)(du)力有(you)關(guan)的(de)基因可(ke)能在(zai)非結(jie)構區，而黃熱病毒(du)(du)(du)(du)屬其他成員的(de)毒(du)(du)(du)(du)力基因多位(wei)于(yu)E蛋(dan)白，這樣構建(jian)的(de)嵌合(he)病毒(du)(du)(du)(du)減(jian)毒(du)(du)(du)(du)機制主(zhu)要(yao)由(you)供(gong)體(ti)株(zhu)的(de)毒(du)(du)(du)(du)性起主(zhu)要(yao)因素，而由(you)DEN一(yi)(yi)2PDK-53減(jian)毒(du)(du)(du)(du)株(zhu)構建(jian)的(de)嵌合(he)疫(yi)苗毒(du)(du)(du)(du)性的(de)減(jian)弱(ruo)由(you)供(gong)體(ti)和(he)(he)(he)受(shou)體(ti)共同決(jue)定，更(geng)有(you)利(li)于(yu)減(jian)毒(du)(du)(du)(du)株(zhu)的(de)獲得(de)
DEN一(yi)2 PDK一(yi)53減毒株
DEN一(yi)(yi)(yi)2減(jian)毒(du)(du)株作為(wei)嵌合(he)病(bing)(bing)毒(du)(du)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)載體還有(you)另(ling)外一(yi)(yi)(yi)個(ge)好處，登革(ge)(ge)病(bing)(bing)毒(du)(du)4個(ge)血(xue)清(qing)型之間產(chan)生(sheng)交(jiao)叉免疫(yi)(yi)力，所以(yi)(yi)異型病(bing)(bing)毒(du)(du)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)二次(ci)感染(ran)由于抗(kang)體依(yi)賴的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)增強(qiang)作用(yong)(yong)可(ke)以(yi)(yi)導致(zhi)登革(ge)(ge)出(chu)血(xue)熱/登革(ge)(ge)熱休(xiu)克(ke)綜合(he)征(DHF/DSS)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)發生(sheng)，理想的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)登革(ge)(ge)4價(jia)疫(yi)(yi)苗(miao)誘(you)導的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)免疫(yi)(yi)力要針對4種(zhong)血(xue)清(qing)型病(bing)(bing)毒(du)(du)，有(you)效(xiao)而(er)且要持久(jiu)，其(qi)中(zhong)任何一(yi)(yi)(yi)種(zhong)血(xue)清(qing)型抗(kang)體的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)消減(jian)都(dou)有(you)發生(sheng)DHF/DSS的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)可(ke)能(neng)。流行病(bing)(bing)學資料表明(ming)，DEN幾(ji)個(ge)血(xue)清(qing)型感染(ran)人的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)概(gai)(gai)率是不(bu)同的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)，其(qi)中(zhong)以(yi)(yi)DEN一(yi)(yi)(yi)2的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)感染(ran)概(gai)(gai)率最高，所以(yi)(yi)由其(qi)它幾(ji)種(zhong)血(xue)清(qing)型病(bing)(bing)毒(du)(du)誘(you)發的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)免疫(yi)(yi)反應很易(yi)識別DEN一(yi)(yi)(yi)2病(bing)(bing)毒(du)(du)，由此(ci)DEN一(yi)(yi)(yi)2病(bing)(bing)毒(du)(du)誘(you)發DHF/DSS的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)概(gai)(gai)率明(ming)顯大于DEN—l、一(yi)(yi)(yi)3、一(yi)(yi)(yi)4；另(ling)外DEN一(yi)(yi)(yi)2病(bing)(bing)毒(du)(du)誘(you)導的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)特異免疫(yi)(yi)力又明(ming)顯弱于其(qi)它3型，所以(yi)(yi)制備以(yi)(yi)DEN一(yi)(yi)(yi)2為(wei)基礎的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)4價(jia)疫(yi)(yi)苗(miao)和傳(chuan)統疫(yi)(yi)苗(miao)比較，減(jian)少了(le)DEN—l、一(yi)(yi)(yi)3、一(yi)(yi)(yi)4的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)4種(zhong)血(xue)清(qing)型NS3蛋白誘(you)發的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)交(jiao)叉免疫(yi)(yi)反應之間的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)干擾作用(yong)(yong)，減(jian)少了(le)DHF/DSS的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)可(ke)能(neng)，同時又能(neng)有(you)效(xiao)而(er)持久(jiu)地誘(you)導機體產(chan)生(sheng)針對4種(zhong)血(xue)清(qing)型的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)免疫(yi)(yi)反應，從而(er)起到預防作用(yong)(yong)。
克隆(long)法(fa) 嵌合(he)病(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)的(de)獲得大多(duo)是(shi)利用感染性(xing)(xing)克隆(long)技術，目前已有部分黃(huang)熱病(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)屬病(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)獲得了感染性(xing)(xing)克隆(long)，如(ru)YFV、TBEV、Kunjin病(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)、墨累(lei)河(he)谷腦炎病(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(MVE)、西尼(ni)羅河(he)病(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(WNV)、DEN4型病(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)，這些克隆(long)包含有病(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)的(de)全部基因(yin)，能夠在(zai)宿(su)主菌中穩定地復制(zhi)和(he)(he)(he)傳代，以作為(wei)種子批保(bao)存。當構(gou)建嵌合(he)體(ti)(ti)時，在(zai)供體(ti)(ti)基因(yin)和(he)(he)(he)受(shou)體(ti)(ti)基因(yin)的(de)連(lian)接處，通過同義突(tu)變(bian)或者保(bao)守突(tu)變(bian)，為(wei)受(shou)體(ti)(ti)株(zhu)和(he)(he)(he)供體(ti)(ti)株(zhu)基因(yin)組(zu)添加合(he)適的(de)酶切位(wei)點，然(ran)后將兩(liang)者利用酶切位(wei)點連(lian)接起(qi)來，制(zhi)備嵌合(he)性(xing)(xing)克隆(long)，體(ti)(ti)外經RNA聚合(he)酶作用轉錄出嵌合(he)性(xing)(xing)轉錄子，轉染細胞后重新(xin)獲得嵌合(he)病(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)。這項技術的(de)一(yi)個優點在(zai)于在(zai)它是(shi)在(zai)cDNA水平(ping)上的(de)操作，突(tu)變(bian)率低(di)、表型穩定，不像傳統(tong)疫(yi)苗(miao)研制(zhi)過程(cheng)中容易發生一(yi)系列的(de)生物(wu)特性(xing)(xing)改變(bian)。
克隆法
融合(he)(he)PCR 利用PCR技術制(zhi)備嵌合(he)(he)病(bing)毒最(zui)大的(de)優點在于方便(bian)快(kuai)捷，過去幾個(ge)月的(de)工作(zuo)現(xian)在幾天就能完成。目前生(sheng)物(wu)技術產(chan)品日(ri)臻完善，不少公(gong)司推出(chu)高保(bao)真、熱穩定性好的(de)逆轉(zhuan)錄酶(mei)和(he)DNA聚(ju)合(he)(he)酶(mei)，如SuperscriptII逆轉(zhuan)錄酶(mei)、LAro~酶(mei)、Exraq酶(mei)、ExpandlongtemplatePCR聚(ju)合(he)(he)酶(mei)系統等，利用這些(xie)酶(mei)可以有效地擴(kuo)增出(chu)病(bing)毒基因組(zu)大片段(duan)(>5kh)甚至全長的(de)cDNA。用4條引物(wu)、3次PCR可以把兩個(ge)異質基因片段(duan)連接(jie)在一起(qi)。另有報道利用3個(ge)引物(wu)、兩次PCR即可制(zhi)備嵌合(he)(he)基因，如YF—MOD嵌合(he)(he)病(bing)毒。
融合PCR
與(yu)克隆技術相比較，PCR方法更為靈(ling)活，可以(yi)選擇(ze)任意(yi)位置(zhi)進(jin)行嵌合；但是PCR具(ju)有(you)一定的突(tu)變率，可能(neng)會(hui)帶來(lai)一些(xie)致死性突(tu)變而(er)使轉錄體不具(ju)有(you)感染性，得不到(dao)恢復(fu)病(bing)毒(du)從而(er)前功盡棄，所(suo)以(yi)現在大(da)多數(shu)實驗還是采取克隆法。
滅(mie)(mie)(mie)活病(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)(du)之(zhi)間的(de)(de)(de)(de)基(ji)(ji)因(yin)重組(zu) 是(shi)將(jiang)(jiang)兩(liang)種或者兩(liang)種以(yi)上的(de)(de)(de)(de)滅(mie)(mie)(mie)活病(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)(du)，在(zai)同(tong)一細胞內培養后，它們之(zhi)間發(fa)(fa)生基(ji)(ji)因(yin)重組(zu)，有時會產生感(gan)(gan)染(ran)性(xing)(xing)病(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)(du)，這種方法又(you)稱為多重復(fu)合(he)，可能由于滅(mie)(mie)(mie)活病(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)(du)受(shou)損的(de)(de)(de)(de)基(ji)(ji)因(yin)經重組(zu)后得(de)以(yi)替補。如(ru)為了解包(bao)膜病(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)(du)的(de)(de)(de)(de)融(rong)(rong)(rong)(rong)合(he)活性(xing)(xing)，利用(yong)黃熱(re)病(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)(du)YF一17DD和(he)流(liu)(liu)感(gan)(gan)病(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)(du)X31兩(liang)者不(bu)(bu)同(tong)的(de)(de)(de)(de)融(rong)(rong)(rong)(rong)合(he)條(tiao)件，以(yi)及核(he)衣(yi)殼(ke)不(bu)(bu)同(tong)的(de)(de)(de)(de)形態，將(jiang)(jiang)YF一17DD通(tong)過酸處理失(shi)去融(rong)(rong)(rong)(rong)合(he)活性(xing)(xing)，X31通(tong)過熱(re)處理滅(mie)(mie)(mie)活，兩(liang)者在(zai)YF一17DD滅(mie)(mie)(mie)活的(de)(de)(de)(de)同(tong)一pH值下發(fa)(fa)生融(rong)(rong)(rong)(rong)和(he)反(fan)(fan)應，只(zhi)有發(fa)(fa)生融(rong)(rong)(rong)(rong)和(he)反(fan)(fan)應的(de)(de)(de)(de)嵌合(he)病(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)(du)具有感(gan)(gan)染(ran)性(xing)(xing)；流(liu)(liu)感(gan)(gan)病(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)(du)提(ti)供功(gong)能型膜蛋(dan)白(bai)融(rong)(rong)(rong)(rong)合(he)成分，YF一17DD提(ti)供功(gong)能基(ji)(ji)因(yin)組(zu)，結果兩(liang)個滅(mie)(mie)(mie)活病(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)(du)又(you)重新構建成新的(de)(de)(de)(de)病(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)(du)。這項(xiang)技(ji)術隨機性(xing)(xing)很大，但是(shi)可能得(de)到(dao)意想(xiang)不(bu)(bu)到(dao)的(de)(de)(de)(de)結果，可以(yi)用(yong)于病(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)(du)功(gong)能的(de)(de)(de)(de)研(yan)究。
黃(huang)熱病毒(du)(du)嵌合病毒(du)(du)的(de)構(gou)建前提在于，所(suo)有(you)的(de)黃(huang)熱病毒(du)(du)的(de)病毒(du)(du)基(ji)因組的(de)結(jie)構(gou)是(shi)高度保守的(de)，它們均為單股正鏈(lian)RNA病毒(du)(du)，基(ji)因組全長(chang)約(yue)l1kb，5端有(you)帽子結(jie)構(gou)，3端無poly(A)尾，一個長(chang)的(de)開放閱讀框架覆蓋了大部分基(ji)因組，共(gong)編碼3個結(jie)構(gou)蛋白和7個非結(jie)構(gou)蛋白，其(qi)中(zhong)以E蛋白和免疫原性關系最為密切，所(suo)以構(gou)建的(de)嵌合病毒(du)(du)一般都要取供體病毒(du)(du)的(de)E基(ji)因；但并不是(shi)所(suo)有(you)構(gou)建的(de)嵌合性cDNA克隆都具有(you)感染性，其(qi)主要影響因素如下。
技(ji)術方面 雖然現在工具(ju)酶的(de)保真性(xing)(xing)(xing)和效率(lv)越(yue)來(lai)越(yue)好(hao)，但是黃熱(re)病毒長10kb以(yi)上，在基(ji)因(yin)操作中不可(ke)(ke)避免(mian)有(you)突(tu)變(bian)的(de)發(fa)生(sheng)，而有(you)些(xie)突(tu)變(bian)是致死性(xing)(xing)(xing)突(tu)變(bian)，使(shi)得構(gou)建的(de)全長cDNA克(ke)隆或者嵌(qian)合體克(ke)隆沒(mei)有(you)感(gan)染(ran)性(xing)(xing)(xing)。另外這些(xie)突(tu)變(bian)還影響恢復(fu)病毒的(de)生(sheng)物學特性(xing)(xing)(xing)，如溫度(du)敏感(gan)性(xing)(xing)(xing)、噬斑大(da)小、復(fu)制能力(li)、嗜(shi)細胞(bao)能力(li)都可(ke)(ke)能發(fa)生(sheng)改(gai)變(bian)。
技術方面
嵌合(he)(he)位(wei)點(dian) 結構蛋(dan)白(bai)(bai)(bai)基因(yin)(yin)之(zhi)間(jian)的(de)(de)(de)連接(jie)處(chu)(chu)有(you)(you)一(yi)段(duan)親(qin)脂(zhi)區(qu)序(xu)列，是構建(jian)嵌合(he)(he)病(bing)(bing)毒時(shi)將兩(liang)段(duan)異質核苷酸序(xu)列進行(xing)連接(jie)的(de)(de)(de)嵌合(he)(he)位(wei)點(dian)處(chu)(chu)，這(zhe)一(yi)段(duan)序(xu)列的(de)(de)(de)保守性對(dui)于嵌合(he)(he)病(bing)(bing)毒的(de)(de)(de)復制能力至關重要(yao)。如(ru)在(zai)(zai)prM和(he)C基因(yin)(yin)之(zhi)間(jian)有(you)(you)信號肽酶切割(ge)位(wei)點(dian)以及蛋(dan)白(bai)(bai)(bai)酶切割(ge)位(wei)點(dian)，Cau—four等在(zai)(zai)構建(jian)YF17D—DEN2嵌合(he)(he)病(bing)(bing)毒時(shi)選擇(ze)這(zhe)兩(liang)處(chu)(chu)作為(wei)嵌合(he)(he)位(wei)點(dian)，結果(guo)在(zai)(zai)信號肽酶切割(ge)位(wei)點(dian)處(chu)(chu)嵌合(he)(he)的(de)(de)(de)病(bing)(bing)毒有(you)(you)感染性，而(er)在(zai)(zai)蛋(dan)白(bai)(bai)(bai)酶切割(ge)位(wei)點(dian)處(chu)(chu)進行(xing)連接(jie)無(wu)法(fa)獲得病(bing)(bing)毒，因(yin)(yin)為(wei)在(zai)(zai)兩(liang)個位(wei)點(dian)之(zhi)間(jian)有(you)(you)一(yi)段(duan)親(qin)脂(zhi)性的(de)(de)(de)轉膜(mo)區(qu)，YFv這(zhe)一(yi)區(qu)域比(bi)DEN一(yi)2該區(qu)域要(yao)多6個氨(an)基酸；在(zai)(zai)蛋(dan)白(bai)(bai)(bai)酶切割(ge)位(wei)點(dian)處(chu)(chu)構建(jian)的(de)(de)(de)嵌合(he)(he)體(ti)，由于這(zhe)一(yi)轉膜(mo)區(qu)缺少了(le)6個氨(an)基酸，蛋(dan)白(bai)(bai)(bai)酶和(he)信號肽酶不能正確識別(bie)切割(ge)位(wei)點(dian)，從而(er)影響prM蛋(dan)白(bai)(bai)(bai)和(he)E蛋(dan)白(bai)(bai)(bai)的(de)(de)(de)成熟(shu)，病(bing)(bing)毒的(de)(de)(de)復制過程受到阻(zu)礙，病(bing)(bing)毒顆(ke)粒沒法(fa)進行(xing)正常的(de)(de)(de)包裝，所以無(wu)法(fa)分泌出病(bing)(bing)毒顆(ke)粒。
嵌合位點
供(gong)體(ti)病(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)基(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin) 目(mu)前構建的(de)(de)(de)嵌(qian)合病(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)多(duo)為(wei)供(gong)體(ti)株提供(gong)P和(he)E基(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)，人們也(ye)嘗試過替代C基(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)或者部分基(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)，但多(duo)數(shu)沒有(you)成功，其可能(neng)的(de)(de)(de)原因(yin)(yin)(yin)是位于(yu)C蛋白區域的(de)(de)(de)保(bao)守(shou)序(xu)(xu)列與(yu)受體(ti)株病(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)順(shun)式(shi)結構不(bu)相容性(xing)(xing)，進而(er)對嵌(qian)合病(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)RNA的(de)(de)(de)復(fu)制(zhi)產生了毒(du)(du)性(xing)(xing)，如Kuniin病(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)RNA復(fu)制(zhi)必須有(you)同源(yuan)C蛋白上的(de)(de)(de)第(di)2位和(he)第(di)20位氨基(ji)(ji)(ji)酸的(de)(de)(de)存，而(er)異質(zhi)基(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)的(de)(de)(de)C蛋白不(bu)能(neng)協助Kunjin病(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)復(fu)制(zhi)，所以無法(fa)長成病(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)顆(ke)粒；另外也(ye)可能(neng)是異質(zhi)病(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)之(zhi)間的(de)(de)(de)蛋白酶識別對方序(xu)(xu)列的(de)(de)(de)能(neng)力(li)低(di)下，對于(yu)C—prM部位的(de)(de)(de)切割效率低(di)，影響病(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)正常的(de)(de)(de)裝(zhuang)配和(he)釋放能(neng)力(li)。
供體病毒
受(shou)(shou)體(ti)(ti)病(bing)(bing)(bing)毒(du)基(ji)(ji)(ji)因(yin) 作為(wei)嵌(qian)(qian)合(he)(he)病(bing)(bing)(bing)毒(du)載體(ti)(ti)，嵌(qian)(qian)合(he)(he)病(bing)(bing)(bing)毒(du)中的(de)(de)大部(bu)分(fen)基(ji)(ji)(ji)因(yin)由(you)受(shou)(shou)體(ti)(ti)株(zhu)提供，嵌(qian)(qian)合(he)(he)病(bing)(bing)(bing)毒(du)的(de)(de)復制特性(xing)(xing)也主要由(you)受(shou)(shou)體(ti)(ti)株(zhu)的(de)(de)基(ji)(ji)(ji)因(yin)控制，其中有(you)(you)些序(xu)列對(dui)于嵌(qian)(qian)合(he)(he)體(ti)(ti)的(de)(de)感染性(xing)(xing)有(you)(you)決(jue)定(ding)性(xing)(xing)作用(yong)，在(zai)構建嵌(qian)(qian)合(he)(he)體(ti)(ti)時，如果這部(bu)分(fen)序(xu)列受(shou)(shou)到破壞，就(jiu)不(bu)能夠獲(huo)得(de)恢復病(bing)(bing)(bing)毒(du)。如在(zai)構建DEN一4和(he)WNV的(de)(de)嵌(qian)(qian)合(he)(he)病(bing)(bing)(bing)毒(du)時四，由(you)WNVNY99的(de)(de)prM和(he)E基(ji)(ji)(ji)因(yin)代(dai)替DEN一4相(xiang)應位置(zhi)的(de)(de)基(ji)(ji)(ji)因(yin)，在(zai)構建的(de)(de)18個(ge)克(ke)隆(long)中僅有(you)(you)兩個(ge)具(ju)有(you)(you)感染性(xing)(xing)，序(xu)列比較(jiao)發現這兩個(ge)克(ke)隆(long)在(zai)prM和(he)C蛋白(bai)(bai)之間的(de)(de)NS2A—NS2B蛋白(bai)(bai)酶(mei)切割位點下(xia)游，在(zai)轉膜信(xin)號區域中都包含(han)一基(ji)(ji)(ji)序(xu)，這一基(ji)(ji)(ji)序(xu)是酶(mei)切割位點下(xia)游的(de)(de)第(di)3位及第(di)6位分(fen)別為(wei)天冬氨酸(suan)和(he)蘇氨酸(suan)，另(ling)外16個(ge)克(ke)隆(long)則(ze)沒有(you)(you)該位點，實驗表明這兩個(ge)位點似乎和(he)嵌(qian)(qian)合(he)(he)性(xing)(xing)克(ke)隆(long)的(de)(de)感染性(xing)(xing)有(you)(you)關。
受體病毒
嵌(qian)合病(bing)毒的(de)一個最大特(te)點是(shi)表型多發(fa)生變(bian)化(hua)，如復制能力(li)(li)、毒力(li)(li)、抗(kang)原性等(deng)，可(ke)能的(de)原因是(shi)由(you)于缺乏校正(zheng)功能的(de)聚合酶(mei)存(cun)在(zai)，而(er)有異(yi)質基因的(de)正(zheng)鏈RNA病(bing)毒，在(zai)病(bing)毒復制中(zhong)具(ju)有較高(gao)的(de)基因突變(bian)率，并且這些突變(bian)為了(le)適應不同(tong)的(de)宿主(zhu)細胞，可(ke)能會發(fa)生一些特(te)性改變(bian)，從(cong)而(er)出(chu)現(xian)一些預想不到的(de)結果。
生長特性(xing)改(gai)變 嵌(qian)合病毒的(de)兩(liang)個母體病毒的(de)易(yi)感細胞不(bu)同，得到的(de)嵌(qian)合病毒在不(bu)同細胞中復制時，由于缺乏有(you)(you)效(xiao)的(de)復制酶而引起生長特性(xing)的(de)改(gai)變，其嗜(shi)細胞性(xing)也會有(you)(you)所(suo)改(gai)變，另(ling)外(wai)噬斑試驗(yan)中噬斑形態(tai)
生長特性改變
大小都多(duo)有變化。如Chimeri—JE嵌(qian)合(he)體(ti)在(zai)(zai)(zai)Vero、LLC—MK，、C6/36細(xi)胞(bao)(bao)中(zhong)復(fu)(fu)制形式類似(si)，而在(zai)(zai)(zai)MRC一5、FRhl細(xi)胞(bao)(bao)中(zhong)雖然病(bing)毒(du)(du)滴度(du)能夠達到6log。0pfu/mL，但(dan)是卻不(bu)能產生CPE，這些特性和(he)母(mu)體(ti)株(zhu)(zhu)YFV以及JEV都截然不(bu)同。LGT1和(he)E5是TBEV的兩(liang)個(ge)弱毒(du)(du)株(zhu)(zhu)，與DEN一4病(bing)毒(du)(du)組成的嵌(qian)合(he)體(ti)在(zai)(zai)(zai)猿猴(hou)細(xi)胞(bao)(bao)中(zhong)復(fu)(fu)制能力(li)下降(jiang)，而轉染蚊(wen)蟲(chong)(chong)細(xi)胞(bao)(bao)復(fu)(fu)制能力(li)不(bu)受(shou)影響，用(yong)在(zai)(zai)(zai)蚊(wen)蟲(chong)(chong)細(xi)胞(bao)(bao)傳代的嵌(qian)合(he)病(bing)毒(du)(du)在(zai)(zai)(zai)猿猴(hou)細(xi)胞(bao)(bao)LLC—MK2中(zhong)不(bu)能夠形成噬(shi)斑，而在(zai)(zai)(zai)早期構(gou)建(jian)的DEN一4和(he)另一個(ge)TBEV病(bing)毒(du)(du)株(zhu)(zhu)構(gou)建(jian)的嵌(qian)合(he)體(ti)在(zai)(zai)(zai)猿猴(hou)細(xi)胞(bao)(bao)中(zhong)卻能夠得到比(bi)DEN一4病(bing)毒(du)(du)滴度(du)高1000倍的嵌(qian)合(he)病(bing)毒(du)(du)。
神(shen)經(jing)(jing)(jing)內毒(du)(du)(du)性(xing)(xing)(xing)和神(shen)經(jing)(jing)(jing)外(wai)(wai)毒(du)(du)(du)性(xing)(xing)(xing) 神(shen)經(jing)(jing)(jing)內(外(wai)(wai))毒(du)(du)(du)性(xing)(xing)(xing)低(di)而免疫原(yuan)(yuan)性(xing)(xing)(xing)好是(shi)一(yi)(yi)個理(li)想(xiang)疫苗(miao)應具備(bei)(bei)的(de)(de)品(pin)質，許多(duo)實(shi)驗室(shi)經(jing)(jing)(jing)過多(duo)年研(yan)究雖然篩檢出一(yi)(yi)些(xie)減毒(du)(du)(du)株(zhu)(zhu)(zhu)(zhu)，但是(shi)兩(liang)者(zhe)多(duo)不能(neng)達(da)到有(you)效的(de)(de)統一(yi)(yi)。嵌(qian)合(he)(he)病毒(du)(du)(du)技(ji)術以“取(qu)長補短”的(de)(de)原(yuan)(yuan)則(ze)，將(jiang)兩(liang)種病毒(du)(du)(du)的(de)(de)免疫原(yuan)(yuan)性(xing)(xing)(xing)和毒(du)(du)(du)性(xing)(xing)(xing)結(jie)合(he)(he)起(qi)來，以期研(yan)制理(li)想(xiang)疫苗(miao)，就(jiu)目前(qian)得到的(de)(de)一(yi)(yi)些(xie)嵌(qian)合(he)(he)株(zhu)(zhu)(zhu)(zhu)來說，確實(shi)取(qu)得了一(yi)(yi)些(xie)令人滿意(yi)的(de)(de)結(jie)果(guo)，如(ru)DEN一(yi)(yi)4和WNV的(de)(de)嵌(qian)合(he)(he)病毒(du)(du)(du)與WNV相比(bi)高度減毒(du)(du)(du)四(si)，腦(nao)內接種戒奶(nai)小(xiao)鼠，神(shen)經(jing)(jing)(jing)內毒(du)(du)(du)性(xing)(xing)(xing)降低(di)至1/28500；腹腔內接種小(xiao)鼠，神(shen)經(jing)(jing)(jing)外(wai)(wai)毒(du)(du)(du)性(xing)(xing)(xing)下(xia)降至1/10000，免疫原(yuan)(yuan)性(xing)(xing)(xing)好，能(neng)安全保護小(xiao)鼠接受野(ye)生株(zhu)(zhu)(zhu)(zhu)攻擊。另外(wai)(wai)如(ru)ChimeriVax—JE嵌(qian)合(he)(he)病毒(du)(du)(du)毒(du)(du)(du)性(xing)(xing)(xing)也較母體(ti)株(zhu)(zhu)(zhu)(zhu)YFV和JEV呈大幅度下(xia)降，而單劑量又具備(bei)(bei)很好的(de)(de)免疫保護力；還(huan)有(you)DEN—TBEV、YFV-DEN、YFV—WNV等(deng)嵌(qian)合(he)(he)病毒(du)(du)(du)株(zhu)(zhu)(zhu)(zhu)的(de)(de)毒(du)(du)(du)性(xing)(xing)(xing)都有(you)所下(xia)降，這(zhe)些(xie)嵌(qian)合(he)(he)體(ti)都在(zai)進(jin)一(yi)(yi)步的(de)(de)研(yan)究中。
神經內毒(du)性和神經外毒(du)性
基(ji)因(yin)穩定(ding)性(xing)(xing) 因(yin)為RNA病(bing)毒(du)易(yi)(yi)以(yi)準(zhun)種的(de)(de)(de)(de)形式出(chu)現(xian)和(he)易(yi)(yi)變(bian)異的(de)(de)(de)(de)特(te)性(xing)(xing)，作為活疫(yi)苗(miao)來使用，一(yi)(yi)個(ge)重要(yao)的(de)(de)(de)(de)條件(jian)是基(ji)因(yin)型要(yao)穩定(ding)，這一(yi)(yi)點是疫(yi)苗(miao)安全性(xing)(xing)的(de)(de)(de)(de)重要(yao)表(biao)現(xian)。嵌合(he)病(bing)毒(du)的(de)(de)(de)(de)穩定(ding)性(xing)(xing)主要(yao)通過返祖實驗檢定(ding)，即在(zai)乳鼠腦內(nei)和(he)細胞(bao)中進(jin)(jin)行(xing)培(pei)養，觀(guan)察有無(wu)明顯表(biao)型變(bian)化，必要(yao)時進(jin)(jin)行(xing)核苷酸(suan)鑒定(ding)，如(ru)ChimeriVax-JE嵌合(he)病(bing)毒(du)115．161在(zai)細胞(bao)內(nei)傳代l8次以(yi)及在(zai)乳鼠腦內(nei)傳代6次并沒(mei)有毒(du)力(li)的(de)(de)(de)(de)回升，對減毒(du)位點進(jin)(jin)行(xing)測序也沒(mei)有發(fa)生核苷酸(suan)改變(bian)。而有的(de)(de)(de)(de)嵌合(he)病(bing)毒(du)穩定(ding)性(xing)(xing)不夠好如(ru)DEN一(yi)(yi)2/DEN一(yi)(yi)4、DEN一(yi)(yi)2/DEN—l復(fu)制(zhi)(zhi)能力(li)較弱，而經過幾次傳代后(hou)得到較高的(de)(de)(de)(de)病(bing)毒(du)滴(di)度，是因(yin)為發(fa)生了一(yi)(yi)些突變(bian)。在(zai)體(ti)(ti)外(wai)轉(zhuan)錄時產(chan)生了轉(zhuan)錄體(ti)(ti)的(de)(de)(de)(de)雜和(he)體(ti)(ti)，在(zai)轉(zhuan)染后(hou)經過細胞(bao)復(fu)制(zhi)(zhi)，復(fu)制(zhi)(zhi)能力(li)增(zeng)強的(de)(de)(de)(de)病(bing)毒(du)逐漸占主要(yao)優勢，在(zai)LLC—MK2細胞(bao)中病(bing)毒(du)傳代可以(yi)保持較高的(de)(de)(de)(de)遺傳穩定(ding)性(xing)(xing)，所以(yi)在(zai)制(zhi)(zhi)備嵌合(he)疫(yi)苗(miao)時，應盡(jin)量減少病(bing)毒(du)在(zai)哺乳動物(wu)細胞(bao)中傳代的(de)(de)(de)(de)次數。
基因穩定性
在(zai)黃熱(re)病(bing)毒嵌合病(bing)毒發(fa)展的這(zhe)十幾年(nian)中(zhong)，人(ren)們(men)嘗試構建了(le)多種嵌合病(bing)毒，其中(zhong)大部分是以(yi)制備(bei)疫苗為目的，另外還用于病(bing)毒的分子生(sheng)物(wu)學特性研究。
分子生物學特性(xing)研究 型(xing)(xing)內嵌合病(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)(du)可以用于了解病(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)(du)復制(zhi)能力，進(jin)一步了解各基因(yin)的(de)功能。如構(gou)建(jian)同型(xing)(xing)不(bu)同株(zhu)之間(jian)DEN一216681/PDK一53、DEN25ol/04株(zhu)之間(jian)的(de)型(xing)(xing)內嵌合疫苗，研究DEN一2型(xing)(xing)病(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)(du)結構(gou)蛋白區對乳鼠(shu)神經毒(du)(du)(du)(du)性(xing)的(de)影響(xiang)。可以用于推測病(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)(du)毒(du)(du)(du)(du)力位(wei)點(dian)，由(you)2個JEV病(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)(du)株(zhu)cDNA克隆提供(gong)5端，3個病(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)(du)株(zhu)cDNA提供(gong)的(de)3端進(jin)行組合，感染(ran)細胞后(hou)重新獲得(de)6種重組JEV病(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)(du)。根據噬菌斑大小篩選(xuan)到3個減(jian)毒(du)(du)(du)(du)株(zhu)，比較6種重組病(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)(du)株(zhu)和(he)野(ye)生株(zhu)的(de)基因(yin)序列(lie)，發(fa)現僅僅是(shi)E138(Glu—Lys)一個氨基酸位(wei)點(dian)不(bu)同，說(shuo)明這個位(wei)點(dian)和(he)毒(du)(du)(du)(du)力之間(jian)關系(xi)密切；另(ling)外發(fa)現該突(tu)變株(zhu)雖然毒(du)(du)(du)(du)性(xing)降低，但(dan)是(shi)腦內注射接種小鼠(shu)后(hou)仍能在腦內復制(zhi)，但(dan)是(shi)病(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)(du)滴度比較低，看(kan)來其減(jian)毒(du)(du)(du)(du)機(ji)制(zhi)不(bu)在于病(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)(du)的(de)復制(zhi)，而可能是(shi)影響(xiang)復制(zhi)的(de)早期機(ji)制(zhi)，在細胞之間(jian)傳遞速度比較慢，從而使(shi)免疫系(xi)統能及時清除病(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)(du)。
分子生(sheng)物學特(te)性研究
型(xing)間(jian)嵌合病(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)(du)(du)也(ye)可以用于分子生(sheng)物(wu)(wu)學特性(xing)(xing)的(de)研究(jiu)，如黃(huang)(huang)熱病(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)(du)(du)和(he)日本腦炎病(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)(du)(du)雖然同(tong)屬黃(huang)(huang)熱病(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)(du)(du)屬，但(dan)是有(you)很(hen)多生(sheng)物(wu)(wu)學特性(xing)(xing)都(dou)(dou)不盡(jin)相同(tong)，如抗原(yuan)性(xing)(xing)相差很(hen)遠、中(zhong)間(jian)宿主不同(tong)、引起人體發病(bing)(bing)(bing)(bing)的(de)癥狀也(ye)截然不同(tong)；兩(liang)者雖然從(cong)同(tong)一病(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)(du)(du)得來(lai)，但(dan)是在(zai)進化(hua)的(de)過程中(zhong)發生(sheng)了很(hen)大的(de)變化(hua)，構(gou)建(jian)的(de)嵌合病(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)(du)(du)YF/JE(S)其生(sheng)物(wu)(wu)學特性(xing)(xing)也(ye)有(you)所改變，如神經(jing)內毒(du)(du)(du)(du)(du)性(xing)(xing)和(he)神經(jing)外毒(du)(du)(du)(du)(du)性(xing)(xing)都(dou)(dou)有(you)所降(jiang)低，和(he)其供(gong)體株SAl4一l4—2相似；而構(gou)建(jian)的(de)另(ling)一個(ge)嵌合株YF/JE(N)神經(jing)毒(du)(du)(du)(du)(du)性(xing)(xing)卻很(hen)高，和(he)供(gong)體株Nakayama特性(xing)(xing)一致(zhi)；這說(shuo)(shuo)明確實如原(yuan)先預料，和(he)減毒(du)(du)(du)(du)(du)有(you)關的(de)表(biao)位主要存在(zai)E蛋(dan)白中(zhong)，而同(tong)時也(ye)發現，和(he)原(yuan)來(lai)的(de)SA14-14-2相比較，嵌合株在(zai)細胞(bao)中(zhong)復(fu)制能力升高，病(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)(du)(du)滴度較高，免疫(yi)原(yuan)性(xing)(xing)增加(jia)，這又說(shuo)(shuo)明是YF一17DD病(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)(du)(du)的(de)非(fei)結(jie)構(gou)蛋(dan)白發揮作用。
候選疫苗(miao) ChimeriVax-JE嵌合病(bing)毒
候選疫苗
日(ri)本腦(nao)炎是(shi)一(yi)種(zhong)(zhong)影響中樞(shu)神(shen)經(jing)系統的(de)(de)(de)(de)疾病(bing)，主(zhu)要流行(xing)于亞洲(zhou)，但是(shi)近年在澳洲(zhou)、美洲(zhou)也有(you)病(bing)例(li)發生，每年官方報道全球有(you)5萬(wan)病(bing)例(li)，其中有(you)l萬(wan)例(li)是(shi)致死性(xing)(xing)的(de)(de)(de)(de)；雖然(ran)目前有(you)活疫(yi)(yi)苗(miao)(miao)、滅活疫(yi)(yi)苗(miao)(miao)的(de)(de)(de)(de)使用(yong)(yong)，但是(shi)這些疫(yi)(yi)苗(miao)(miao)具有(you)免疫(yi)(yi)原(yuan)性(xing)(xing)不夠(gou)、價格偏高、制作工(gong)藝(yi)不被WHO認可等劣勢(shi)，所以還(huan)有(you)必要開發研制新疫(yi)(yi)苗(miao)(miao)。1999年Chambers等以SA14-14-2的(de)(de)(de)(de)prM和E基因代替YF一(yi)17DD疫(yi)(yi)苗(miao)(miao)株的(de)(de)(de)(de)相(xiang)應基因構建(jian)了嵌合(he)(he)病(bing)毒(du)(du)(du)ChimeriVax—JE15,16,，該病(bing)毒(du)(du)(du)能(neng)在WHO認可的(de)(de)(de)(de)細(xi)胞中很好(hao)地被培養，恢復病(bing)毒(du)(du)(du)和YF一(yi)17DD、SA14—14-2相(xiang)比較(jiao)，以6log0pfu的(de)(de)(de)(de)嵌合(he)(he)病(bing)毒(du)(du)(du)腦(nao)內接(jie)種(zhong)(zhong)3-4周齡小鼠無一(yi)例(li)發病(bing)，而(er)(er)接(jie)種(zhong)(zhong)YF-17DD的(de)(de)(de)(de)小鼠全部死亡；另外用(yong)(yong)3．2log0pfu劑量的(de)(de)(de)(de)SA14-14-2接(jie)種(zhong)(zhong)，能(neng)在85%一(yi)95%的(de)(de)(de)(de)接(jie)種(zhong)(zhong)者中產生中和抗體(ti)，抗體(ti)平均滴度能(neng)夠(gou)達(da)到(dao)PRNT~o<30，血清陽轉率(lv)小于80%；而(er)(er)接(jie)種(zhong)(zhong)4~51og0pfu的(de)(de)(de)(de)嵌合(he)(he)疫(yi)(yi)苗(miao)(miao)后，能(neng)夠(gou)達(da)到(dao)100%的(de)(de)(de)(de)血清陽轉率(lv)，接(jie)種(zhong)(zhong)后30dPRNT能(neng)夠(gou)達(da)到(dao)129~327，這些結(jie)果表(biao)明構建(jian)的(de)(de)(de)(de)嵌合(he)(he)病(bing)毒(du)(du)(du)神(shen)經(jing)內毒(du)(du)(du)性(xing)(xing)呈大幅度降(jiang)低；用(yong)(yong)乳(ru)鼠以及猴子(zi)進行(xing)安全試驗(yan)檢測，進一(yi)步證實了該病(bing)毒(du)(du)(du)的(de)(de)(de)(de)弱神(shen)經(jing)毒(du)(du)(du)性(xing)(xing)，內臟毒(du)(du)(du)性(xing)(xing)也下降(jiang)。目前該疫(yi)(yi)苗(miao)(miao)已(yi)經(jing)通過一(yi)期臨(lin)床試驗(yan)，是(shi)很有(you)前途的(de)(de)(de)(de)疫(yi)(yi)苗(miao)(miao)候(hou)選株。
登革病(bing)毒多價疫苗
登(deng)革(ge)病毒(du)是目(mu)前誘發(fa)疾病最(zui)多的(de)黃熱病毒(du)，在人(ren)口聚集的(de)熱帶(dai)及亞熱帶(dai)時(shi)有(you)爆發(fa)，因為(wei)登(deng)革(ge)病毒(du)4個血(xue)清(qing)(qing)(qing)型(xing)之間可以產(chan)(chan)生交叉(cha)保(bao)護力，所以感染(ran)一(yi)(yi)(yi)種(zhong)(zhong)病毒(du)后，能夠對另外3種(zhong)(zhong)血(xue)清(qing)(qing)(qing)型(xing)病毒(du)的(de)抗(kang)體(ti)(ti)(ti)(ti)反應。在機體(ti)(ti)(ti)(ti)遭(zao)受(shou)另一(yi)(yi)(yi)種(zhong)(zhong)血(xue)清(qing)(qing)(qing)型(xing)病毒(du)的(de)感染(ran)后，由于抗(kang)體(ti)(ti)(ti)(ti)依賴的(de)復制能力增(zeng)強(qiang)作用可能誘發(fa)DHF/DSS的(de)發(fa)生，因此理想的(de)疫(yi)苗應該能夠產(chan)(chan)生針對4個型(xing)病毒(du)的(de)中和(he)抗(kang)體(ti)(ti)(ti)(ti)和(he)T細胞免疫(yi)。目(mu)前主要有(you)兩個實(shi)驗室分(fen)別以DEN一(yi)(yi)(yi)2PDK一(yi)(yi)(yi)53和(he)YF一(yi)(yi)(yi)17DD作為(wei)受(shou)體(ti)(ti)(ti)(ti)株構建了包(bao)括DEN一(yi)(yi)(yi)1到DEN-4型(xing)的(de)嵌(qian)合株，結果有(you)很好(hao)的(de)免疫(yi)原性(xing)、較(jiao)高的(de)復制效率和(he)穩定(ding)性(xing)，在動物(wu)實(shi)驗中證明毒(du)性(xing)減(jian)低，小鼠效力實(shi)驗安全有(you)效，有(you)望成(cheng)為(wei)登(deng)革(ge)病毒(du)疫(yi)苗的(de)發(fa)展(zhan)方(fang)向。
另(ling)外還(huan)有YF/TBE、YF/WNV、DEN4/TBE的(de)報(bao)道，都(dou)出(chu)現一些(xie)令人(ren)滿意的(de)特性(xing)，進(jin)一步(bu)研究正在進(jin)行中(zhong)。嵌合病毒(du)的(de)出(chu)現是獲得(de)減(jian)毒(du)活(huo)疫苗的(de)一個新途徑，和(he)傳統(tong)方法相比具有目(mu)標明確、免疫效果好、減(jian)毒(du)穩定的(de)優勢，但該(gai)技術(shu)目(mu)前(qian)還(huan)處于探索階段，有時結果很出(chu)人(ren)意料，所以在構建一個新的(de)嵌合體時，要時刻注意安全性(xing)問題，否(fou)則會適得(de)其反，創造出(chu)新的(de)毒(du)性(xing)更強的(de)病毒(du)，為(wei)人(ren)類帶來危(wei)害。
嵌(qian)合(he)疫(yi)苗(miao)是應(ying)用(yong)(yong)基因工程(cheng)手(shou)段構建基因能表達兩種(zhong)以上病(bing)(bing)原體抗(kang)原的一類(lei)新(xin)型疫(yi)苗(miao),應(ying)用(yong)(yong)嵌(qian)合(he)疫(yi)苗(miao)可解(jie)決(jue)多次(ci)接種(zhong)問題。本文綜(zong)述了(le)目(mu)前(qian)(qian)世界一些(xie)國(guo)家研(yan)制的嵌(qian)合(he)疫(yi)苗(miao),如登革(ge)病(bing)(bing)毒(du)、乙型腦炎病(bing)(bing)毒(du)、呼(hu)吸道合(he)胞病(bing)(bing)毒(du)、副流感病(bing)(bing)毒(du)、人(ren)類(lei)免疫(yi)缺陷病(bing)(bing)病(bing)(bing)毒(du)及(ji)人(ren)乳頭瘤(liu)病(bing)(bing)毒(du)等相關嵌(qian)合(he)疫(yi)苗(miao)的研(yan)究(jiu)策略和方法、免疫(yi)學評價及(ji)其應(ying)用(yong)(yong)前(qian)(qian)景(jing)。
精靈世(shi)界
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