黃(huang)熱(re)病毒(du)(du)(du)屬(1qav/virus)包含(han)80多個成員(yuan)，屬于正(zheng)鏈RNA病毒(du)(du)(du)，其中(zhong)半數以上的(de)病毒(du)(du)(du)能(neng)夠誘發人和動物產(chan)生疾病，患(huan)病率高而治愈率低，容(rong)易留下(xia)一(yi)些嚴重的(de)后(hou)遺癥，給人類(lei)健康帶(dai)來(lai)很大威脅，如流行(xing)性(xing)乙(yi)型(xing)腦炎(yan)病毒(du)(du)(du)(JEV)、登革(ge)熱(re)病病毒(du)(du)(du)(DEN)、黃(huang)熱(re)病毒(du)(du)(du)(YFV)、蜱傳腦炎(yan)病毒(du)(du)(du)(TBEV)等。一(yi)直以來(lai)人們對(dui)RNA病毒(du)(du)(du)的(de)了解都比(bi)較(jiao)缺(que)乏，無論(lun)是(shi)分子水平(ping)上的(de)機(ji)理研(yan)究，還是(shi)宏觀上疫苗的(de)研(yan)制、藥物的(de)開發，其進展都非常緩慢。
嵌合(he)病(bing)毒(du)(du)是一(yi)(yi)種基(ji)因工程重組(zu)(zu)病(bing)毒(du)(du)，在(zai)制(zhi)備技(ji)術上并不存(cun)在(zai)太大問題，但作為(wei)重組(zu)(zu)病(bing)毒(du)(du)，在(zai)安全(quan)性(xing)上還有(you)一(yi)(yi)定(ding)的(de)(de)(de)風(feng)險(xian)，在(zai)自然條件下，有(you)病(bing)毒(du)(du)之(zhi)間(jian)自發(fa)產生重組(zu)(zu)的(de)(de)(de)例子(zi)，可能(neng)獲得一(yi)(yi)些意想不到的(de)(de)(de)新型病(bing)毒(du)(du)，比母體株毒(du)(du)力更強，對(dui)生物體更具有(you)威脅性(xing)。所(suo)以在(zai)制(zhi)備嵌合(he)病(bing)毒(du)(du)時(shi)，要采(cai)(cai)用(yong)已知(zhi)特性(xing)的(de)(de)(de)病(bing)毒(du)(du)株作為(wei)嵌合(he)病(bing)毒(du)(du)的(de)(de)(de)骨架(jia)結構(gou)，特別是多選用(yong)減毒(du)(du)株作為(wei)載(zai)體病(bing)毒(du)(du)目(mu)前黃熱病(bing)毒(du)(du)的(de)(de)(de)嵌合(he)病(bing)毒(du)(du)采(cai)(cai)用(yong)的(de)(de)(de)載(zai)體主要有(you)以下幾種。
YF一(yi)17DD 疫(yi)(yi)(yi)苗(miao)(miao)(miao)(miao)株(zhu)(zhu) YF一(yi)17DD是(shi)目(mu)前(qian)預防黃(huang)熱病(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)(du)(du)感染的(de)(de)(de)一(yi)株(zhu)(zhu)減毒(du)(du)(du)(du)(du)活疫(yi)(yi)(yi)苗(miao)(miao)(miao)(miao)】，始用于1936年，在(zai)過去的(de)(de)(de)6O多年中，有(you)超過3億人接(jie)種過該(gai)疫(yi)(yi)(yi)苗(miao)(miao)(miao)(miao)，安(an)全有(you)效。該(gai)疫(yi)(yi)(yi)苗(miao)(miao)(miao)(miao)株(zhu)(zhu)免疫(yi)(yi)(yi)原(yuan)(yuan)性很好(hao)，單劑量(liang)接(jie)種后(hou)10d內，近lo0%的(de)(de)(de)接(jie)種者(zhe)產生(sheng)中和(he)抗(kang)體(ti)，免疫(yi)(yi)(yi)力持(chi)久甚(shen)至能夠維持(chi)終身。將(jiang)YF一(yi)17DD疫(yi)(yi)(yi)苗(miao)(miao)(miao)(miao)株(zhu)(zhu)和(he)原(yuan)(yuan)病(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)(du)(du)株(zhu)(zhu)YF—Asibi進行序列(lie)比較后(hou)發現，該(gai)病(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)(du)(du)的(de)(de)(de)抗(kang)原(yuan)(yuan)表位多集中在(zai)E基(ji)(ji)(ji)因，構(gou)建嵌(qian)(qian)合(he)(he)病(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)(du)(du)多以(yi)(yi)這(zhe)一(yi)段基(ji)(ji)(ji)因作(zuo)(zuo)為(wei)(wei)靶(ba)基(ji)(ji)(ji)因。這(zhe)樣構(gou)建的(de)(de)(de)嵌(qian)(qian)合(he)(he)病(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)(du)(du)中，由YF一(yi)17DD株(zhu)(zhu)保留的(de)(de)(de)NS蛋白(bai)基(ji)(ji)(ji)因只是(shi)誘(you)發針對該(gai)蛋白(bai)的(de)(de)(de)CTLs和(he)非中和(he)性抗(kang)體(ti)，而不具有(you)交叉保護性，所以(yi)(yi)嵌(qian)(qian)合(he)(he)病(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)(du)(du)作(zuo)(zuo)為(wei)(wei)疫(yi)(yi)(yi)苗(miao)(miao)(miao)(miao)使(shi)用時不會引起一(yi)般重組病(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)(du)(du)帶(dai)來(lai)的(de)(de)(de)抗(kang)載體(ti)免疫(yi)(yi)(yi)反應，即使(shi)曾經接(jie)種過YF一(yi)17DD的(de)(de)(de)接(jie)痘者(zhe)再(zai)接(jie)種嵌(qian)(qian)合(he)(he)病(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)(du)(du)也是(shi)安(an)全有(you)效的(de)(de)(de)，可以(yi)(yi)作(zuo)(zuo)為(wei)(wei)一(yi)個理(li)想的(de)(de)(de)活疫(yi)(yi)(yi)苗(miao)(miao)(miao)(miao)株(zhu)(zhu)嵌(qian)(qian)合(he)(he)病(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)(du)(du)載體(ti)。1989年Rice等(deng)151構(gou)建了(le)YF一(yi)17DD的(de)(de)(de)感染性克(ke)隆，為(wei)(wei)構(gou)建嵌(qian)(qian)合(he)(he)病(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)(du)(du)提供了(le)方便，目(mu)前(qian)文獻中報道的(de)(de)(de)有(you)關黃(huang)熱病(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)(du)(du)嵌(qian)(qian)合(he)(he)株(zhu)(zhu)多以(yi)(yi)此病(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)(du)(du)株(zhu)(zhu)作(zuo)(zuo)為(wei)(wei)載體(ti)病(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)(du)(du)。已經成功構(gou)建了(le)包括JEV、TBE、WNV、DEN等(deng)4個血清(qing)型病(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)(du)(du)的(de)(de)(de)嵌(qian)(qian)合(he)(he)體(ti)。
YF一(yi)17DD 疫(yi)苗株
DEN一(yi)(yi)(yi)4變(bian)異株(zhu)(zhu) 登革病(bing)毒(du)(du)(du)(du)分(fen)為4個血(xue)清(qing)型，這4型病(bing)毒(du)(du)(du)(du)結(jie)構蛋白(bai)氨(an)基(ji)酸(suan)序列同源(yuan)性(xing)(xing)(xing)(xing)高達62%-74%，并且它們之間還有(you)很(hen)好的(de)(de)(de)(de)交叉免疫(yi)原(yuan)性(xing)(xing)(xing)(xing)，一(yi)(yi)(yi)直以來(lai)，人們試(shi)圖構建登革病(bing)毒(du)(du)(du)(du)的(de)(de)(de)(de)4價疫(yi)苗，Bray等從1991年開(kai)始登革病(bing)毒(du)(du)(du)(du)嵌合病(bing)毒(du)(du)(du)(du)的(de)(de)(de)(de)研究，以DEN一(yi)(yi)(yi)4814669株(zhu)(zhu)全長克隆作(zuo)為載(zai)(zai)(zai)體(ti)，構建了包括DEN—l到DEN一(yi)(yi)(yi)3的(de)(de)(de)(de)嵌合病(bing)毒(du)(du)(du)(du)，結(jie)果發現(xian)幾株(zhu)(zhu)病(bing)毒(du)(du)(du)(du)的(de)(de)(de)(de)毒(du)(du)(du)(du)性(xing)(xing)(xing)(xing)并沒(mei)有(you)太大改變(bian)，他們認為若(ruo)能夠以一(yi)(yi)(yi)個毒(du)(du)(du)(du)性(xing)(xing)(xing)(xing)低(di)的(de)(de)(de)(de)DEN-4病(bing)毒(du)(du)(du)(du)作(zuo)為載(zai)(zai)(zai)體(ti)骨架，可(ke)能會使嵌合病(bing)毒(du)(du)(du)(du)毒(du)(du)(du)(du)性(xing)(xing)(xing)(xing)下降(jiang)(jiang)，由于3端(duan)和(he)5端(duan)非(fei)編碼(ma)區在(zai)病(bing)毒(du)(du)(du)(du)的(de)(de)(de)(de)復制中可(ke)能也起到調控作(zuo)用，他們在(zai)構建的(de)(de)(de)(de)DEN一(yi)(yi)(yi)4感染性(xing)(xing)(xing)(xing)克隆的(de)(de)(de)(de)基(ji)礎上，刪除其(qi)(qi)3端(duan)和(he)5端(duan)非(fei)編碼(ma)區的(de)(de)(de)(de)部(bu)分(fen)序列，結(jie)果篩選到一(yi)(yi)(yi)株(zhu)(zhu)減毒(du)(du)(du)(du)株(zhu)(zhu)，其(qi)(qi)3端(duan)去掉了3O個核苷酸(suan)，毒(du)(du)(du)(du)性(xing)(xing)(xing)(xing)降(jiang)(jiang)低(di)但是免疫(yi)原(yuan)性(xing)(xing)(xing)(xing)并沒(mei)有(you)改變(bian)。用這個減毒(du)(du)(du)(du)株(zhu)(zhu)作(zuo)為載(zai)(zai)(zai)體(ti)和(he)其(qi)(qi)它3個血(xue)清(qing)型的(de)(de)(de)(de)登革病(bing)毒(du)(du)(du)(du)構成(cheng)嵌合病(bing)毒(du)(du)(du)(du)后，果然有(you)效地(di)降(jiang)(jiang)低(di)了病(bing)毒(du)(du)(du)(du)毒(du)(du)(du)(du)性(xing)(xing)(xing)(xing)；其(qi)(qi)后這個載(zai)(zai)(zai)體(ti)也用于構建黃熱(re)病(bing)毒(du)(du)(du)(du)屬其(qi)(qi)他成(cheng)員的(de)(de)(de)(de)嵌合病(bing)毒(du)(du)(du)(du)。
DEN一4變異株(zhu)
DEN一2 PDK一53減(jian)(jian)(jian)(jian)毒(du)(du)(du)(du)株(zhu)(zhu)(zhu)(zhu) 該減(jian)(jian)(jian)(jian)毒(du)(du)(du)(du)株(zhu)(zhu)(zhu)(zhu)也主(zhu)(zhu)要是(shi)用于(yu)合(he)成登革病(bing)毒(du)(du)(du)(du)的(de)(de)嵌(qian)合(he)疫(yi)苗，2O世(shi)紀8O年(nian)代初期(qi)，泰國Mahidol實(shi)驗室將4種(zhong)血清型的(de)(de)登革病(bing)毒(du)(du)(du)(du)經過在(zai)細胞傳代中后獲得(de)各自的(de)(de)減(jian)(jian)(jian)(jian)毒(du)(du)(du)(du)株(zhu)(zhu)(zhu)(zhu)，其(qi)中以DEN一2PDK一53減(jian)(jian)(jian)(jian)毒(du)(du)(du)(du)株(zhu)(zhu)(zhu)(zhu)減(jian)(jian)(jian)(jian)毒(du)(du)(du)(du)效(xiao)果(guo)最好，免疫(yi)保(bao)護(hu)力最強最持久(jiu)。將該減(jian)(jian)(jian)(jian)毒(du)(du)(du)(du)株(zhu)(zhu)(zhu)(zhu)和野(ye)生株(zhu)(zhu)(zhu)(zhu)進行比較(jiao)，發現(xian)核(he)苷酸水平上的(de)(de)變異(yi)主(zhu)(zhu)要在(zai)非結構(gou)區，說明該病(bing)毒(du)(du)(du)(du)株(zhu)(zhu)(zhu)(zhu)和毒(du)(du)(du)(du)力有關的(de)(de)基因可(ke)能(neng)在(zai)非結構(gou)區，而(er)黃熱病(bing)毒(du)(du)(du)(du)屬(shu)其(qi)他成員的(de)(de)毒(du)(du)(du)(du)力基因多位于(yu)E蛋白，這樣構(gou)建的(de)(de)嵌(qian)合(he)病(bing)毒(du)(du)(du)(du)減(jian)(jian)(jian)(jian)毒(du)(du)(du)(du)機制(zhi)主(zhu)(zhu)要由(you)供體(ti)(ti)株(zhu)(zhu)(zhu)(zhu)的(de)(de)毒(du)(du)(du)(du)性(xing)起主(zhu)(zhu)要因素，而(er)由(you)DEN一2PDK-53減(jian)(jian)(jian)(jian)毒(du)(du)(du)(du)株(zhu)(zhu)(zhu)(zhu)構(gou)建的(de)(de)嵌(qian)合(he)疫(yi)苗毒(du)(du)(du)(du)性(xing)的(de)(de)減(jian)(jian)(jian)(jian)弱由(you)供體(ti)(ti)和受體(ti)(ti)共(gong)同決定(ding)，更有利于(yu)減(jian)(jian)(jian)(jian)毒(du)(du)(du)(du)株(zhu)(zhu)(zhu)(zhu)的(de)(de)獲得(de)
DEN一2 PDK一53減毒株
DEN一(yi)(yi)2減(jian)毒(du)(du)(du)(du)株(zhu)作(zuo)(zuo)為嵌合病毒(du)(du)(du)(du)的(de)(de)(de)(de)(de)載(zai)體(ti)還有(you)另外一(yi)(yi)個好處，登(deng)革(ge)(ge)病毒(du)(du)(du)(du)4個血(xue)清(qing)型(xing)之間產生(sheng)交叉免(mian)疫(yi)(yi)力(li)，所(suo)以(yi)異型(xing)病毒(du)(du)(du)(du)的(de)(de)(de)(de)(de)二(er)次感(gan)(gan)染(ran)由(you)于(yu)抗體(ti)依賴的(de)(de)(de)(de)(de)增(zeng)強(qiang)作(zuo)(zuo)用可(ke)以(yi)導(dao)致登(deng)革(ge)(ge)出血(xue)熱(re)/登(deng)革(ge)(ge)熱(re)休克綜合征(DHF/DSS)的(de)(de)(de)(de)(de)發(fa)(fa)生(sheng)，理(li)想(xiang)的(de)(de)(de)(de)(de)登(deng)革(ge)(ge)4價疫(yi)(yi)苗(miao)(miao)(miao)誘(you)(you)(you)導(dao)的(de)(de)(de)(de)(de)免(mian)疫(yi)(yi)力(li)要針(zhen)對4種(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)血(xue)清(qing)型(xing)病毒(du)(du)(du)(du)，有(you)效而且要持久，其(qi)(qi)中任何一(yi)(yi)種(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)血(xue)清(qing)型(xing)抗體(ti)的(de)(de)(de)(de)(de)消減(jian)都(dou)有(you)發(fa)(fa)生(sheng)DHF/DSS的(de)(de)(de)(de)(de)可(ke)能。流行病學資料表明(ming)，DEN幾個血(xue)清(qing)型(xing)感(gan)(gan)染(ran)人的(de)(de)(de)(de)(de)概(gai)率(lv)是(shi)不同(tong)的(de)(de)(de)(de)(de)，其(qi)(qi)中以(yi)DEN一(yi)(yi)2的(de)(de)(de)(de)(de)感(gan)(gan)染(ran)概(gai)率(lv)最高，所(suo)以(yi)由(you)其(qi)(qi)它幾種(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)血(xue)清(qing)型(xing)病毒(du)(du)(du)(du)誘(you)(you)(you)發(fa)(fa)的(de)(de)(de)(de)(de)免(mian)疫(yi)(yi)反應很(hen)易(yi)識別DEN一(yi)(yi)2病毒(du)(du)(du)(du)，由(you)此DEN一(yi)(yi)2病毒(du)(du)(du)(du)誘(you)(you)(you)發(fa)(fa)DHF/DSS的(de)(de)(de)(de)(de)概(gai)率(lv)明(ming)顯大于(yu)DEN—l、一(yi)(yi)3、一(yi)(yi)4；另外DEN一(yi)(yi)2病毒(du)(du)(du)(du)誘(you)(you)(you)導(dao)的(de)(de)(de)(de)(de)特異免(mian)疫(yi)(yi)力(li)又明(ming)顯弱于(yu)其(qi)(qi)它3型(xing)，所(suo)以(yi)制備以(yi)DEN一(yi)(yi)2為基礎的(de)(de)(de)(de)(de)4價疫(yi)(yi)苗(miao)(miao)(miao)和(he)傳(chuan)統疫(yi)(yi)苗(miao)(miao)(miao)比(bi)較，減(jian)少了DEN—l、一(yi)(yi)3、一(yi)(yi)4的(de)(de)(de)(de)(de)4種(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)血(xue)清(qing)型(xing)NS3蛋白誘(you)(you)(you)發(fa)(fa)的(de)(de)(de)(de)(de)交叉免(mian)疫(yi)(yi)反應之間的(de)(de)(de)(de)(de)干擾作(zuo)(zuo)用，減(jian)少了DHF/DSS的(de)(de)(de)(de)(de)可(ke)能，同(tong)時又能有(you)效而持久地誘(you)(you)(you)導(dao)機體(ti)產生(sheng)針(zhen)對4種(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)血(xue)清(qing)型(xing)的(de)(de)(de)(de)(de)免(mian)疫(yi)(yi)反應，從而起到預防(fang)作(zuo)(zuo)用。
克隆法 嵌(qian)(qian)合(he)(he)(he)病(bing)(bing)毒的獲(huo)得大多是(shi)(shi)利用(yong)感(gan)染(ran)性克隆技術，目前(qian)已有(you)部分黃熱(re)病(bing)(bing)毒屬病(bing)(bing)毒獲(huo)得了感(gan)染(ran)性克隆，如YFV、TBEV、Kunjin病(bing)(bing)毒、墨累河(he)谷腦炎病(bing)(bing)毒(MVE)、西(xi)尼(ni)羅河(he)病(bing)(bing)毒(WNV)、DEN4型病(bing)(bing)毒，這(zhe)些克隆包(bao)含有(you)病(bing)(bing)毒的全部基(ji)(ji)因，能夠(gou)在(zai)宿(su)主(zhu)菌中穩定(ding)地復(fu)制和傳代，以作(zuo)為(wei)種(zhong)子(zi)批保存。當構建嵌(qian)(qian)合(he)(he)(he)體(ti)(ti)時，在(zai)供體(ti)(ti)基(ji)(ji)因和受體(ti)(ti)基(ji)(ji)因的連接(jie)處(chu)，通過同義突變(bian)或者保守突變(bian)，為(wei)受體(ti)(ti)株(zhu)和供體(ti)(ti)株(zhu)基(ji)(ji)因組添加合(he)(he)(he)適的酶(mei)(mei)切(qie)位點，然(ran)后將兩者利用(yong)酶(mei)(mei)切(qie)位點連接(jie)起來，制備嵌(qian)(qian)合(he)(he)(he)性克隆，體(ti)(ti)外經RNA聚(ju)合(he)(he)(he)酶(mei)(mei)作(zuo)用(yong)轉(zhuan)(zhuan)錄出(chu)嵌(qian)(qian)合(he)(he)(he)性轉(zhuan)(zhuan)錄子(zi)，轉(zhuan)(zhuan)染(ran)細胞后重新獲(huo)得嵌(qian)(qian)合(he)(he)(he)病(bing)(bing)毒。這(zhe)項(xiang)技術的一個優點在(zai)于(yu)在(zai)它(ta)是(shi)(shi)在(zai)cDNA水(shui)平上(shang)的操作(zuo)，突變(bian)率低(di)、表(biao)型穩定(ding)，不像傳統(tong)疫苗研制過程中容易(yi)發生(sheng)一系列的生(sheng)物特性改變(bian)。
克隆法
融合PCR 利(li)用PCR技(ji)術制(zhi)備嵌(qian)合病毒最大的優點在于方(fang)便快捷(jie)，過去幾(ji)個月的工(gong)作(zuo)現(xian)在幾(ji)天就能完成。目(mu)前生物技(ji)術產品(pin)日臻完善，不少公司推出(chu)高保真、熱(re)穩定性好(hao)的逆轉(zhuan)(zhuan)錄酶和DNA聚合酶，如SuperscriptII逆轉(zhuan)(zhuan)錄酶、LAro~酶、Exraq酶、ExpandlongtemplatePCR聚合酶系統等，利(li)用這些酶可以有(you)效地擴增(zeng)出(chu)病毒基因組大片段(duan)(duan)(>5kh)甚至(zhi)全長的cDNA。用4條引物、3次PCR可以把兩個異質基因片段(duan)(duan)連接(jie)在一起。另(ling)有(you)報(bao)道利(li)用3個引物、兩次PCR即可制(zhi)備嵌(qian)合基因，如YF—MOD嵌(qian)合病毒。
融合PCR
與克(ke)隆(long)(long)技術相比(bi)較，PCR方法更為靈(ling)活(huo)，可以(yi)(yi)選(xuan)擇任(ren)意位置進行嵌合；但(dan)是(shi)PCR具(ju)有(you)一定的突(tu)變率(lv)，可能會(hui)帶來一些致(zhi)死性突(tu)變而(er)使轉錄體不具(ju)有(you)感(gan)染(ran)性，得不到恢復(fu)病毒從而(er)前功盡棄，所以(yi)(yi)現(xian)在大(da)多數實驗還是(shi)采取(qu)克(ke)隆(long)(long)法。
滅活病(bing)(bing)毒(du)(du)(du)(du)之間的(de)(de)(de)基(ji)因(yin)(yin)(yin)重組(zu) 是將(jiang)兩(liang)種或(huo)者(zhe)兩(liang)種以上的(de)(de)(de)滅活病(bing)(bing)毒(du)(du)(du)(du)，在(zai)同一(yi)(yi)細胞內培養后，它們之間發生基(ji)因(yin)(yin)(yin)重組(zu)，有(you)時(shi)會產生感(gan)染(ran)性(xing)病(bing)(bing)毒(du)(du)(du)(du)，這(zhe)種方法又(you)稱(cheng)為多重復合(he)，可(ke)(ke)能(neng)(neng)由(you)于滅活病(bing)(bing)毒(du)(du)(du)(du)受損(sun)的(de)(de)(de)基(ji)因(yin)(yin)(yin)經(jing)重組(zu)后得(de)以替補。如為了(le)解包膜病(bing)(bing)毒(du)(du)(du)(du)的(de)(de)(de)融(rong)合(he)活性(xing)，利用黃熱病(bing)(bing)毒(du)(du)(du)(du)YF一(yi)(yi)17DD和流(liu)感(gan)病(bing)(bing)毒(du)(du)(du)(du)X31兩(liang)者(zhe)不同的(de)(de)(de)融(rong)合(he)條件(jian)，以及核(he)衣(yi)殼不同的(de)(de)(de)形態(tai)，將(jiang)YF一(yi)(yi)17DD通過(guo)酸處(chu)理失去融(rong)合(he)活性(xing)，X31通過(guo)熱處(chu)理滅活，兩(liang)者(zhe)在(zai)YF一(yi)(yi)17DD滅活的(de)(de)(de)同一(yi)(yi)pH值下發生融(rong)和反應，只有(you)發生融(rong)和反應的(de)(de)(de)嵌合(he)病(bing)(bing)毒(du)(du)(du)(du)具有(you)感(gan)染(ran)性(xing)；流(liu)感(gan)病(bing)(bing)毒(du)(du)(du)(du)提供功(gong)能(neng)(neng)型膜蛋白融(rong)合(he)成分(fen)，YF一(yi)(yi)17DD提供功(gong)能(neng)(neng)基(ji)因(yin)(yin)(yin)組(zu)，結果兩(liang)個滅活病(bing)(bing)毒(du)(du)(du)(du)又(you)重新構(gou)建成新的(de)(de)(de)病(bing)(bing)毒(du)(du)(du)(du)。這(zhe)項(xiang)技(ji)術隨機性(xing)很(hen)大(da)，但是可(ke)(ke)能(neng)(neng)得(de)到意想不到的(de)(de)(de)結果，可(ke)(ke)以用于病(bing)(bing)毒(du)(du)(du)(du)功(gong)能(neng)(neng)的(de)(de)(de)研究。
黃(huang)熱病(bing)(bing)毒(du)嵌合病(bing)(bing)毒(du)的(de)構(gou)建前(qian)提在于，所有的(de)黃(huang)熱病(bing)(bing)毒(du)的(de)病(bing)(bing)毒(du)基(ji)(ji)因(yin)組(zu)的(de)結構(gou)是高度保守的(de)，它們均為(wei)單股正鏈RNA病(bing)(bing)毒(du)，基(ji)(ji)因(yin)組(zu)全(quan)長約l1kb，5端有帽子結構(gou)，3端無(wu)poly(A)尾，一個(ge)長的(de)開放閱讀框架覆蓋了大部分基(ji)(ji)因(yin)組(zu)，共編碼3個(ge)結構(gou)蛋白(bai)和7個(ge)非結構(gou)蛋白(bai)，其中(zhong)以E蛋白(bai)和免疫原性關系最為(wei)密(mi)切，所以構(gou)建的(de)嵌合病(bing)(bing)毒(du)一般(ban)都(dou)要取供體(ti)病(bing)(bing)毒(du)的(de)E基(ji)(ji)因(yin)；但并不是所有構(gou)建的(de)嵌合性cDNA克(ke)隆(long)都(dou)具有感染性，其主要影響因(yin)素(su)如下。
技(ji)術方面 雖然現在工(gong)具酶(mei)的保真性和效率(lv)越來越好，但是(shi)黃熱病(bing)(bing)毒(du)長10kb以上(shang)，在基因操作(zuo)中不可避免(mian)有(you)突變(bian)(bian)的發生(sheng)，而有(you)些突變(bian)(bian)是(shi)致(zhi)死性突變(bian)(bian)，使得(de)構建(jian)的全(quan)長cDNA克隆或(huo)者嵌合體克隆沒有(you)感染性。另外這些突變(bian)(bian)還(huan)影響恢復病(bing)(bing)毒(du)的生(sheng)物學(xue)特性，如溫度敏感性、噬斑大小、復制能力(li)、嗜細(xi)胞能力(li)都可能發生(sheng)改變(bian)(bian)。
技術方面
嵌(qian)(qian)合(he)位(wei)(wei)(wei)點(dian)(dian) 結構蛋(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)基(ji)因之間的(de)連(lian)接(jie)(jie)處有一段親脂區序列，是(shi)構建嵌(qian)(qian)合(he)病(bing)毒(du)(du)(du)時將兩段異(yi)質核(he)苷酸序列進(jin)行連(lian)接(jie)(jie)的(de)嵌(qian)(qian)合(he)位(wei)(wei)(wei)點(dian)(dian)處，這一段序列的(de)保守(shou)性對(dui)于嵌(qian)(qian)合(he)病(bing)毒(du)(du)(du)的(de)復(fu)制(zhi)能力至關重要。如在(zai)(zai)(zai)prM和C基(ji)因之間有信號肽酶切(qie)割(ge)(ge)(ge)位(wei)(wei)(wei)點(dian)(dian)以(yi)及蛋(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)酶切(qie)割(ge)(ge)(ge)位(wei)(wei)(wei)點(dian)(dian)，Cau—four等在(zai)(zai)(zai)構建YF17D—DEN2嵌(qian)(qian)合(he)病(bing)毒(du)(du)(du)時選擇(ze)這兩處作為嵌(qian)(qian)合(he)位(wei)(wei)(wei)點(dian)(dian)，結果在(zai)(zai)(zai)信號肽酶切(qie)割(ge)(ge)(ge)位(wei)(wei)(wei)點(dian)(dian)處嵌(qian)(qian)合(he)的(de)病(bing)毒(du)(du)(du)有感染性，而在(zai)(zai)(zai)蛋(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)酶切(qie)割(ge)(ge)(ge)位(wei)(wei)(wei)點(dian)(dian)處進(jin)行連(lian)接(jie)(jie)無法獲得病(bing)毒(du)(du)(du)，因為在(zai)(zai)(zai)兩個(ge)(ge)位(wei)(wei)(wei)點(dian)(dian)之間有一段親脂性的(de)轉(zhuan)膜區，YFv這一區域(yu)(yu)比DEN一2該區域(yu)(yu)要多6個(ge)(ge)氨基(ji)酸；在(zai)(zai)(zai)蛋(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)酶切(qie)割(ge)(ge)(ge)位(wei)(wei)(wei)點(dian)(dian)處構建的(de)嵌(qian)(qian)合(he)體，由于這一轉(zhuan)膜區缺少(shao)了(le)6個(ge)(ge)氨基(ji)酸，蛋(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)酶和信號肽酶不能正(zheng)確識別切(qie)割(ge)(ge)(ge)位(wei)(wei)(wei)點(dian)(dian)，從而影(ying)響prM蛋(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)和E蛋(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)的(de)成熟，病(bing)毒(du)(du)(du)的(de)復(fu)制(zhi)過程受(shou)到阻礙(ai)，病(bing)毒(du)(du)(du)顆(ke)粒沒法進(jin)行正(zheng)常(chang)的(de)包裝(zhuang)，所以(yi)無法分泌出病(bing)毒(du)(du)(du)顆(ke)粒。
嵌合位點
供體(ti)病(bing)(bing)(bing)毒(du)基(ji)因(yin)(yin) 目(mu)前構建的(de)嵌(qian)合(he)病(bing)(bing)(bing)毒(du)多(duo)為供體(ti)株提供P和E基(ji)因(yin)(yin)，人們也(ye)嘗(chang)試過(guo)替代C基(ji)因(yin)(yin)或者部分基(ji)因(yin)(yin)，但(dan)多(duo)數沒有成功，其可能(neng)的(de)原因(yin)(yin)是(shi)位(wei)于C蛋白區域的(de)保守序列與受(shou)體(ti)株病(bing)(bing)(bing)毒(du)順式結構不相容性，進而對(dui)嵌(qian)合(he)病(bing)(bing)(bing)毒(du)RNA的(de)復制產生了毒(du)性，如Kuniin病(bing)(bing)(bing)毒(du)RNA復制必須有同源C蛋白上的(de)第(di)2位(wei)和第(di)20位(wei)氨基(ji)酸的(de)存，而異質基(ji)因(yin)(yin)的(de)C蛋白不能(neng)協助Kunjin病(bing)(bing)(bing)毒(du)復制，所(suo)以(yi)無法(fa)長成病(bing)(bing)(bing)毒(du)顆粒；另(ling)外(wai)也(ye)可能(neng)是(shi)異質病(bing)(bing)(bing)毒(du)之間的(de)蛋白酶識別(bie)對(dui)方序列的(de)能(neng)力低下，對(dui)于C—prM部位(wei)的(de)切割效率(lv)低，影響病(bing)(bing)(bing)毒(du)正常的(de)裝配和釋放能(neng)力。
供體病毒
受(shou)體(ti)病毒(du)基(ji)(ji)因(yin) 作為嵌(qian)(qian)合(he)病毒(du)載體(ti)，嵌(qian)(qian)合(he)病毒(du)中(zhong)的(de)(de)(de)大(da)部(bu)分基(ji)(ji)因(yin)由受(shou)體(ti)株(zhu)提(ti)供，嵌(qian)(qian)合(he)病毒(du)的(de)(de)(de)復制特性也主要(yao)由受(shou)體(ti)株(zhu)的(de)(de)(de)基(ji)(ji)因(yin)控制，其(qi)中(zhong)有(you)(you)些序(xu)(xu)列(lie)(lie)對于嵌(qian)(qian)合(he)體(ti)的(de)(de)(de)感(gan)染(ran)性有(you)(you)決定性作用，在(zai)構(gou)建(jian)嵌(qian)(qian)合(he)體(ti)時，如(ru)果這(zhe)部(bu)分序(xu)(xu)列(lie)(lie)受(shou)到破壞，就不(bu)能夠(gou)獲得恢(hui)復病毒(du)。如(ru)在(zai)構(gou)建(jian)DEN一4和(he)WNV的(de)(de)(de)嵌(qian)(qian)合(he)病毒(du)時四，由WNVNY99的(de)(de)(de)prM和(he)E基(ji)(ji)因(yin)代(dai)替DEN一4相應位(wei)置的(de)(de)(de)基(ji)(ji)因(yin)，在(zai)構(gou)建(jian)的(de)(de)(de)18個(ge)(ge)克隆(long)中(zhong)僅有(you)(you)兩(liang)個(ge)(ge)具(ju)有(you)(you)感(gan)染(ran)性，序(xu)(xu)列(lie)(lie)比較(jiao)發現這(zhe)兩(liang)個(ge)(ge)克隆(long)在(zai)prM和(he)C蛋白之間(jian)的(de)(de)(de)NS2A—NS2B蛋白酶切割位(wei)點下游(you)，在(zai)轉(zhuan)膜信號(hao)區域(yu)中(zhong)都包(bao)含一基(ji)(ji)序(xu)(xu)，這(zhe)一基(ji)(ji)序(xu)(xu)是酶切割位(wei)點下游(you)的(de)(de)(de)第3位(wei)及第6位(wei)分別為天(tian)冬氨酸(suan)和(he)蘇氨酸(suan)，另外16個(ge)(ge)克隆(long)則沒(mei)有(you)(you)該位(wei)點，實驗表(biao)明這(zhe)兩(liang)個(ge)(ge)位(wei)點似乎和(he)嵌(qian)(qian)合(he)性克隆(long)的(de)(de)(de)感(gan)染(ran)性有(you)(you)關。
受體病毒
嵌合病(bing)毒的(de)(de)一個最大特(te)點(dian)是(shi)表型多(duo)發(fa)生變化，如(ru)復(fu)制能力、毒力、抗原(yuan)性等(deng)，可能的(de)(de)原(yuan)因是(shi)由于缺(que)乏校(xiao)正功能的(de)(de)聚(ju)合酶存在，而有異質(zhi)基因的(de)(de)正鏈RNA病(bing)毒，在病(bing)毒復(fu)制中具有較高(gao)的(de)(de)基因突(tu)變率，并且這些突(tu)變為了適應(ying)不(bu)同(tong)的(de)(de)宿(su)主細(xi)胞(bao)，可能會發(fa)生一些特(te)性改變，從而出現(xian)一些預想不(bu)到(dao)的(de)(de)結果。
生長特性改(gai)變(bian) 嵌合(he)病毒的(de)兩個母(mu)體病毒的(de)易(yi)感細(xi)(xi)胞(bao)不同，得到的(de)嵌合(he)病毒在不同細(xi)(xi)胞(bao)中復制時，由于(yu)缺乏有(you)效的(de)復制酶而引(yin)起(qi)生長特性的(de)改(gai)變(bian)，其嗜細(xi)(xi)胞(bao)性也會有(you)所改(gai)變(bian)，另外噬斑(ban)試驗(yan)中噬斑(ban)形態
生長特性改變
大小都(dou)多有變(bian)化。如Chimeri—JE嵌(qian)(qian)合體在Vero、LLC—MK，、C6/36細胞(bao)(bao)(bao)中(zhong)(zhong)復(fu)制形式類似，而在MRC一5、FRhl細胞(bao)(bao)(bao)中(zhong)(zhong)雖然(ran)病毒(du)滴度能(neng)(neng)(neng)夠(gou)達到6log。0pfu/mL，但是卻不能(neng)(neng)(neng)產(chan)生(sheng)CPE，這(zhe)些特性(xing)和(he)母體株(zhu)YFV以及JEV都(dou)截然(ran)不同(tong)。LGT1和(he)E5是TBEV的(de)(de)(de)兩個弱毒(du)株(zhu)，與DEN一4病毒(du)組(zu)成的(de)(de)(de)嵌(qian)(qian)合體在猿猴(hou)(hou)細胞(bao)(bao)(bao)中(zhong)(zhong)復(fu)制能(neng)(neng)(neng)力(li)下降，而轉染蚊蟲(chong)細胞(bao)(bao)(bao)復(fu)制能(neng)(neng)(neng)力(li)不受(shou)影響，用在蚊蟲(chong)細胞(bao)(bao)(bao)傳代的(de)(de)(de)嵌(qian)(qian)合病毒(du)在猿猴(hou)(hou)細胞(bao)(bao)(bao)LLC—MK2中(zhong)(zhong)不能(neng)(neng)(neng)夠(gou)形成噬斑，而在早期構建(jian)的(de)(de)(de)DEN一4和(he)另(ling)一個TBEV病毒(du)株(zhu)構建(jian)的(de)(de)(de)嵌(qian)(qian)合體在猿猴(hou)(hou)細胞(bao)(bao)(bao)中(zhong)(zhong)卻能(neng)(neng)(neng)夠(gou)得(de)到比DEN一4病毒(du)滴度高1000倍的(de)(de)(de)嵌(qian)(qian)合病毒(du)。
神(shen)經(jing)內(nei)(nei)毒(du)(du)性(xing)和神(shen)經(jing)外(wai)(wai)(wai)毒(du)(du)性(xing) 神(shen)經(jing)內(nei)(nei)(外(wai)(wai)(wai))毒(du)(du)性(xing)低而免(mian)疫(yi)(yi)原(yuan)性(xing)好(hao)是一(yi)個理(li)想(xiang)疫(yi)(yi)苗(miao)應具(ju)備的(de)品質，許(xu)多實驗室(shi)經(jing)過(guo)多年研(yan)究雖然篩檢出一(yi)些(xie)(xie)減(jian)毒(du)(du)株(zhu)，但(dan)是兩者多不能達(da)到有(you)效的(de)統一(yi)。嵌合(he)病(bing)(bing)毒(du)(du)技術(shu)以“取(qu)長補短”的(de)原(yuan)則(ze)，將(jiang)兩種(zhong)病(bing)(bing)毒(du)(du)的(de)免(mian)疫(yi)(yi)原(yuan)性(xing)和毒(du)(du)性(xing)結合(he)起來，以期(qi)研(yan)制理(li)想(xiang)疫(yi)(yi)苗(miao)，就(jiu)目前得到的(de)一(yi)些(xie)(xie)嵌合(he)株(zhu)來說，確實取(qu)得了一(yi)些(xie)(xie)令人滿意的(de)結果(guo)，如(ru)DEN一(yi)4和WNV的(de)嵌合(he)病(bing)(bing)毒(du)(du)與WNV相比高(gao)度減(jian)毒(du)(du)四，腦內(nei)(nei)接種(zhong)戒奶小鼠(shu)，神(shen)經(jing)內(nei)(nei)毒(du)(du)性(xing)降(jiang)低至(zhi)1/28500；腹腔內(nei)(nei)接種(zhong)小鼠(shu)，神(shen)經(jing)外(wai)(wai)(wai)毒(du)(du)性(xing)下降(jiang)至(zhi)1/10000，免(mian)疫(yi)(yi)原(yuan)性(xing)好(hao)，能安全(quan)保護小鼠(shu)接受野生(sheng)株(zhu)攻擊。另(ling)外(wai)(wai)(wai)如(ru)ChimeriVax—JE嵌合(he)病(bing)(bing)毒(du)(du)毒(du)(du)性(xing)也(ye)較(jiao)母(mu)體株(zhu)YFV和JEV呈(cheng)大幅度下降(jiang)，而單劑量又(you)具(ju)備很(hen)好(hao)的(de)免(mian)疫(yi)(yi)保護力；還有(you)DEN—TBEV、YFV-DEN、YFV—WNV等(deng)嵌合(he)病(bing)(bing)毒(du)(du)株(zhu)的(de)毒(du)(du)性(xing)都有(you)所下降(jiang)，這些(xie)(xie)嵌合(he)體都在進一(yi)步的(de)研(yan)究中。
神(shen)經內毒性和(he)神(shen)經外毒性
基因(yin)穩(wen)定(ding)性(xing) 因(yin)為RNA病(bing)毒(du)(du)(du)(du)易以(yi)準(zhun)種的(de)(de)形式出現和易變(bian)異的(de)(de)特性(xing)，作(zuo)為活疫(yi)(yi)苗(miao)來使用，一(yi)個重(zhong)要(yao)(yao)的(de)(de)條件(jian)是(shi)基因(yin)型要(yao)(yao)穩(wen)定(ding)，這(zhe)一(yi)點是(shi)疫(yi)(yi)苗(miao)安(an)全性(xing)的(de)(de)重(zhong)要(yao)(yao)表現。嵌(qian)合病(bing)毒(du)(du)(du)(du)的(de)(de)穩(wen)定(ding)性(xing)主要(yao)(yao)通過(guo)返祖實驗(yan)檢定(ding)，即在(zai)乳鼠腦內和細(xi)胞中進(jin)行(xing)培養，觀察有無明顯表型變(bian)化，必(bi)要(yao)(yao)時(shi)進(jin)行(xing)核(he)苷酸(suan)鑒(jian)定(ding)，如ChimeriVax-JE嵌(qian)合病(bing)毒(du)(du)(du)(du)115．161在(zai)細(xi)胞內傳(chuan)(chuan)代(dai)l8次以(yi)及(ji)在(zai)乳鼠腦內傳(chuan)(chuan)代(dai)6次并(bing)沒有毒(du)(du)(du)(du)力的(de)(de)回升，對減毒(du)(du)(du)(du)位(wei)點進(jin)行(xing)測序也(ye)沒有發生(sheng)核(he)苷酸(suan)改變(bian)。而(er)有的(de)(de)嵌(qian)合病(bing)毒(du)(du)(du)(du)穩(wen)定(ding)性(xing)不(bu)夠好(hao)如DEN一(yi)2/DEN一(yi)4、DEN一(yi)2/DEN—l復(fu)制能力較(jiao)弱(ruo)，而(er)經(jing)過(guo)幾(ji)次傳(chuan)(chuan)代(dai)后得到較(jiao)高(gao)的(de)(de)病(bing)毒(du)(du)(du)(du)滴度，是(shi)因(yin)為發生(sheng)了一(yi)些突變(bian)。在(zai)體外轉(zhuan)錄(lu)時(shi)產生(sheng)了轉(zhuan)錄(lu)體的(de)(de)雜(za)和體，在(zai)轉(zhuan)染(ran)后經(jing)過(guo)細(xi)胞復(fu)制，復(fu)制能力增強的(de)(de)病(bing)毒(du)(du)(du)(du)逐漸占(zhan)主要(yao)(yao)優(you)勢，在(zai)LLC—MK2細(xi)胞中病(bing)毒(du)(du)(du)(du)傳(chuan)(chuan)代(dai)可以(yi)保持(chi)較(jiao)高(gao)的(de)(de)遺傳(chuan)(chuan)穩(wen)定(ding)性(xing)，所以(yi)在(zai)制備嵌(qian)合疫(yi)(yi)苗(miao)時(shi)，應盡量(liang)減少病(bing)毒(du)(du)(du)(du)在(zai)哺乳動物細(xi)胞中傳(chuan)(chuan)代(dai)的(de)(de)次數。
基因穩定性
在黃(huang)熱病(bing)毒嵌合(he)病(bing)毒發展的(de)這十幾年(nian)中(zhong)(zhong)，人們嘗試構(gou)建(jian)了多種嵌合(he)病(bing)毒，其中(zhong)(zhong)大(da)部分(fen)是以制備疫苗為目的(de)，另外還用(yong)于(yu)病(bing)毒的(de)分(fen)子生物(wu)學特性研究。
分子生(sheng)物學特(te)性研究(jiu) 型內(nei)(nei)(nei)嵌合(he)(he)病(bing)(bing)毒(du)(du)(du)(du)(du)可(ke)以用(yong)于(yu)了解(jie)病(bing)(bing)毒(du)(du)(du)(du)(du)復(fu)(fu)制(zhi)能(neng)(neng)(neng)力(li)，進一步了解(jie)各基(ji)因的功能(neng)(neng)(neng)。如(ru)構(gou)建同型不(bu)(bu)同株(zhu)(zhu)(zhu)之(zhi)間DEN一216681/PDK一53、DEN25ol/04株(zhu)(zhu)(zhu)之(zhi)間的型內(nei)(nei)(nei)嵌合(he)(he)疫苗，研究(jiu)DEN一2型病(bing)(bing)毒(du)(du)(du)(du)(du)結構(gou)蛋白區(qu)對乳鼠(shu)神(shen)經毒(du)(du)(du)(du)(du)性的影響(xiang)。可(ke)以用(yong)于(yu)推測病(bing)(bing)毒(du)(du)(du)(du)(du)毒(du)(du)(du)(du)(du)力(li)位點，由2個(ge)JEV病(bing)(bing)毒(du)(du)(du)(du)(du)株(zhu)(zhu)(zhu)cDNA克隆提(ti)供5端，3個(ge)病(bing)(bing)毒(du)(du)(du)(du)(du)株(zhu)(zhu)(zhu)cDNA提(ti)供的3端進行組(zu)合(he)(he)，感染(ran)細胞后重新獲得6種(zhong)重組(zu)JEV病(bing)(bing)毒(du)(du)(du)(du)(du)。根據噬菌斑大小(xiao)篩(shai)選到3個(ge)減毒(du)(du)(du)(du)(du)株(zhu)(zhu)(zhu)，比較6種(zhong)重組(zu)病(bing)(bing)毒(du)(du)(du)(du)(du)株(zhu)(zhu)(zhu)和(he)野生(sheng)株(zhu)(zhu)(zhu)的基(ji)因序(xu)列，發現僅僅是E138(Glu—Lys)一個(ge)氨(an)基(ji)酸位點不(bu)(bu)同，說明這個(ge)位點和(he)毒(du)(du)(du)(du)(du)力(li)之(zhi)間關系密(mi)切；另外發現該突變株(zhu)(zhu)(zhu)雖然毒(du)(du)(du)(du)(du)性降低，但是腦內(nei)(nei)(nei)注射接種(zhong)小(xiao)鼠(shu)后仍能(neng)(neng)(neng)在腦內(nei)(nei)(nei)復(fu)(fu)制(zhi)，但是病(bing)(bing)毒(du)(du)(du)(du)(du)滴(di)度比較低，看來其減毒(du)(du)(du)(du)(du)機制(zhi)不(bu)(bu)在于(yu)病(bing)(bing)毒(du)(du)(du)(du)(du)的復(fu)(fu)制(zhi)，而可(ke)能(neng)(neng)(neng)是影響(xiang)復(fu)(fu)制(zhi)的早期(qi)機制(zhi)，在細胞之(zhi)間傳遞(di)速(su)度比較慢，從而使免疫系統能(neng)(neng)(neng)及時清除病(bing)(bing)毒(du)(du)(du)(du)(du)。
分子生物學特性研究
型間嵌(qian)(qian)合病(bing)(bing)毒(du)(du)也(ye)可以用于分(fen)子(zi)生(sheng)物(wu)(wu)學(xue)特(te)性的(de)(de)(de)研究，如(ru)黃熱病(bing)(bing)毒(du)(du)和日本腦(nao)炎(yan)病(bing)(bing)毒(du)(du)雖然同屬(shu)黃熱病(bing)(bing)毒(du)(du)屬(shu)，但(dan)是(shi)(shi)有(you)(you)很(hen)多生(sheng)物(wu)(wu)學(xue)特(te)性都不盡相(xiang)(xiang)同，如(ru)抗(kang)原性相(xiang)(xiang)差(cha)很(hen)遠、中(zhong)(zhong)(zhong)間宿主不同、引起(qi)人體發病(bing)(bing)的(de)(de)(de)癥狀也(ye)截(jie)然不同；兩者雖然從同一(yi)病(bing)(bing)毒(du)(du)得(de)來(lai)，但(dan)是(shi)(shi)在(zai)進化的(de)(de)(de)過程中(zhong)(zhong)(zhong)發生(sheng)了很(hen)大的(de)(de)(de)變化，構建(jian)的(de)(de)(de)嵌(qian)(qian)合病(bing)(bing)毒(du)(du)YF/JE(S)其生(sheng)物(wu)(wu)學(xue)特(te)性也(ye)有(you)(you)所(suo)改變，如(ru)神經(jing)(jing)內毒(du)(du)性和神經(jing)(jing)外毒(du)(du)性都有(you)(you)所(suo)降(jiang)低，和其供體株(zhu)SAl4一(yi)l4—2相(xiang)(xiang)似；而構建(jian)的(de)(de)(de)另一(yi)個嵌(qian)(qian)合株(zhu)YF/JE(N)神經(jing)(jing)毒(du)(du)性卻很(hen)高(gao)，和供體株(zhu)Nakayama特(te)性一(yi)致(zhi)；這說明確實如(ru)原先預料，和減毒(du)(du)有(you)(you)關(guan)的(de)(de)(de)表位主要存在(zai)E蛋白(bai)中(zhong)(zhong)(zhong)，而同時也(ye)發現，和原來(lai)的(de)(de)(de)SA14-14-2相(xiang)(xiang)比較，嵌(qian)(qian)合株(zhu)在(zai)細胞中(zhong)(zhong)(zhong)復制能力升高(gao)，病(bing)(bing)毒(du)(du)滴度較高(gao)，免(mian)疫原性增加，這又(you)說明是(shi)(shi)YF一(yi)17DD病(bing)(bing)毒(du)(du)的(de)(de)(de)非結構蛋白(bai)發揮(hui)作用。
候選疫(yi)苗 ChimeriVax-JE嵌合病毒
候選疫苗
日本腦炎(yan)是(shi)一(yi)(yi)種(zhong)影響中(zhong)樞神(shen)經(jing)系統的(de)(de)(de)(de)(de)疾病(bing)(bing)，主要流行于亞洲，但是(shi)近年(nian)在(zai)澳洲、美洲也有病(bing)(bing)例發(fa)生，每年(nian)官(guan)方(fang)報道(dao)全(quan)球有5萬(wan)病(bing)(bing)例，其中(zhong)有l萬(wan)例是(shi)致死(si)性的(de)(de)(de)(de)(de)；雖然目前(qian)有活疫(yi)苗(miao)(miao)(miao)(miao)(miao)(miao)、滅活疫(yi)苗(miao)(miao)(miao)(miao)(miao)(miao)的(de)(de)(de)(de)(de)使用，但是(shi)這些疫(yi)苗(miao)(miao)(miao)(miao)(miao)(miao)具有免疫(yi)原性不(bu)(bu)夠(gou)、價格(ge)偏高、制(zhi)作工藝(yi)不(bu)(bu)被WHO認可等劣勢(shi)，所以還有必(bi)要開發(fa)研制(zhi)新疫(yi)苗(miao)(miao)(miao)(miao)(miao)(miao)。1999年(nian)Chambers等以SA14-14-2的(de)(de)(de)(de)(de)prM和E基因代替(ti)YF一(yi)(yi)17DD疫(yi)苗(miao)(miao)(miao)(miao)(miao)(miao)株(zhu)的(de)(de)(de)(de)(de)相(xiang)應基因構建了嵌合(he)病(bing)(bing)毒(du)(du)ChimeriVax—JE15,16,，該(gai)病(bing)(bing)毒(du)(du)能(neng)(neng)(neng)在(zai)WHO認可的(de)(de)(de)(de)(de)細胞中(zhong)很(hen)好地被培養，恢復病(bing)(bing)毒(du)(du)和YF一(yi)(yi)17DD、SA14—14-2相(xiang)比較，以6log0pfu的(de)(de)(de)(de)(de)嵌合(he)病(bing)(bing)毒(du)(du)腦內接(jie)(jie)(jie)種(zhong)3-4周齡小鼠無一(yi)(yi)例發(fa)病(bing)(bing)，而接(jie)(jie)(jie)種(zhong)YF-17DD的(de)(de)(de)(de)(de)小鼠全(quan)部(bu)死(si)亡；另(ling)外用3．2log0pfu劑量的(de)(de)(de)(de)(de)SA14-14-2接(jie)(jie)(jie)種(zhong)，能(neng)(neng)(neng)在(zai)85%一(yi)(yi)95%的(de)(de)(de)(de)(de)接(jie)(jie)(jie)種(zhong)者(zhe)中(zhong)產生中(zhong)和抗體(ti)(ti)，抗體(ti)(ti)平均滴度能(neng)(neng)(neng)夠(gou)達到PRNT~o<30，血(xue)清陽轉率小于80%；而接(jie)(jie)(jie)種(zhong)4~51og0pfu的(de)(de)(de)(de)(de)嵌合(he)疫(yi)苗(miao)(miao)(miao)(miao)(miao)(miao)后，能(neng)(neng)(neng)夠(gou)達到100%的(de)(de)(de)(de)(de)血(xue)清陽轉率，接(jie)(jie)(jie)種(zhong)后30dPRNT能(neng)(neng)(neng)夠(gou)達到129~327，這些結果表(biao)明(ming)構建的(de)(de)(de)(de)(de)嵌合(he)病(bing)(bing)毒(du)(du)神(shen)經(jing)內毒(du)(du)性呈大幅度降低(di)；用乳(ru)鼠以及猴子進(jin)行安(an)全(quan)試驗(yan)檢測，進(jin)一(yi)(yi)步證實了該(gai)病(bing)(bing)毒(du)(du)的(de)(de)(de)(de)(de)弱神(shen)經(jing)毒(du)(du)性，內臟毒(du)(du)性也下降。目前(qian)該(gai)疫(yi)苗(miao)(miao)(miao)(miao)(miao)(miao)已經(jing)通過一(yi)(yi)期臨床試驗(yan)，是(shi)很(hen)有前(qian)途的(de)(de)(de)(de)(de)疫(yi)苗(miao)(miao)(miao)(miao)(miao)(miao)候(hou)選株(zhu)。
登革病毒多價疫苗(miao)
登(deng)革(ge)病(bing)毒是目(mu)前(qian)誘發(fa)(fa)疾病(bing)最多(duo)的(de)(de)(de)(de)(de)黃熱(re)病(bing)毒，在人口(kou)聚集的(de)(de)(de)(de)(de)熱(re)帶及亞熱(re)帶時(shi)有(you)(you)爆發(fa)(fa)，因為(wei)登(deng)革(ge)病(bing)毒4個血清型之(zhi)間可(ke)以產生交叉保護力，所以感(gan)染(ran)(ran)一(yi)(yi)種病(bing)毒后，能(neng)夠對另外3種血清型病(bing)毒的(de)(de)(de)(de)(de)抗體(ti)反應。在機體(ti)遭受另一(yi)(yi)種血清型病(bing)毒的(de)(de)(de)(de)(de)感(gan)染(ran)(ran)后，由(you)于抗體(ti)依賴(lai)的(de)(de)(de)(de)(de)復制(zhi)能(neng)力增強作用可(ke)能(neng)誘發(fa)(fa)DHF/DSS的(de)(de)(de)(de)(de)發(fa)(fa)生，因此理想的(de)(de)(de)(de)(de)疫(yi)苗應該能(neng)夠產生針對4個型病(bing)毒的(de)(de)(de)(de)(de)中和(he)(he)抗體(ti)和(he)(he)T細胞免疫(yi)。目(mu)前(qian)主要有(you)(you)兩個實(shi)驗室(shi)分(fen)別以DEN一(yi)(yi)2PDK一(yi)(yi)53和(he)(he)YF一(yi)(yi)17DD作為(wei)受體(ti)株構(gou)建了(le)包(bao)括DEN一(yi)(yi)1到(dao)DEN-4型的(de)(de)(de)(de)(de)嵌合株，結果有(you)(you)很好的(de)(de)(de)(de)(de)免疫(yi)原性、較高(gao)的(de)(de)(de)(de)(de)復制(zhi)效率和(he)(he)穩定性，在動物實(shi)驗中證明毒性減低，小鼠(shu)效力實(shi)驗安(an)全(quan)有(you)(you)效，有(you)(you)望成為(wei)登(deng)革(ge)病(bing)毒疫(yi)苗的(de)(de)(de)(de)(de)發(fa)(fa)展方(fang)向。
另(ling)外還(huan)有YF/TBE、YF/WNV、DEN4/TBE的(de)(de)(de)報道，都出現一些令人(ren)滿意的(de)(de)(de)特性(xing)，進(jin)一步研究正在進(jin)行中。嵌(qian)合(he)病毒的(de)(de)(de)出現是獲得(de)減毒活疫苗(miao)的(de)(de)(de)一個新途徑，和傳統方法相比具(ju)有目標明確、免疫效果好、減毒穩定的(de)(de)(de)優勢(shi)，但該(gai)技術目前還(huan)處于探索(suo)階段，有時結果很出人(ren)意料(liao)，所以(yi)在構建一個新的(de)(de)(de)嵌(qian)合(he)體時，要時刻(ke)注意安全性(xing)問(wen)題，否則(ze)會適得(de)其反，創造(zao)出新的(de)(de)(de)毒性(xing)更強(qiang)的(de)(de)(de)病毒，為人(ren)類帶來危害(hai)。
嵌合(he)疫(yi)(yi)(yi)苗是(shi)應用基因工程手段構建基因能表達兩(liang)種以上病(bing)(bing)原(yuan)體抗原(yuan)的(de)(de)一(yi)類新型疫(yi)(yi)(yi)苗,應用嵌合(he)疫(yi)(yi)(yi)苗可解決多次接種問題。本(ben)文綜述(shu)了目(mu)前世(shi)界一(yi)些國(guo)家研制(zhi)的(de)(de)嵌合(he)疫(yi)(yi)(yi)苗,如登革(ge)病(bing)(bing)毒(du)、乙型腦炎病(bing)(bing)毒(du)、呼(hu)吸道合(he)胞病(bing)(bing)毒(du)、副(fu)流感病(bing)(bing)毒(du)、人(ren)類免疫(yi)(yi)(yi)缺(que)陷病(bing)(bing)病(bing)(bing)毒(du)及人(ren)乳頭瘤病(bing)(bing)毒(du)等相關嵌合(he)疫(yi)(yi)(yi)苗的(de)(de)研究策略和方法、免疫(yi)(yi)(yi)學評(ping)價(jia)及其應用前景。
精靈世界
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