黃(huang)熱(re)病(bing)(bing)(bing)毒(du)屬(1qav/virus)包(bao)含80多個成員(yuan)，屬于(yu)正(zheng)鏈RNA病(bing)(bing)(bing)毒(du)，其中(zhong)半數以(yi)上的(de)病(bing)(bing)(bing)毒(du)能夠(gou)誘發人和(he)動物產(chan)生疾病(bing)(bing)(bing)，患病(bing)(bing)(bing)率高而治愈(yu)率低，容易留下一些嚴重的(de)后(hou)遺(yi)癥(zheng)，給(gei)人類健康帶來很大威脅，如(ru)流(liu)行(xing)性乙型腦炎(yan)病(bing)(bing)(bing)毒(du)(JEV)、登革熱(re)病(bing)(bing)(bing)病(bing)(bing)(bing)毒(du)(DEN)、黃(huang)熱(re)病(bing)(bing)(bing)毒(du)(YFV)、蜱(pi)傳腦炎(yan)病(bing)(bing)(bing)毒(du)(TBEV)等。一直(zhi)以(yi)來人們(men)對RNA病(bing)(bing)(bing)毒(du)的(de)了解(jie)都(dou)比較缺(que)乏，無論是分子(zi)水平上的(de)機理研(yan)究，還是宏觀上疫苗的(de)研(yan)制、藥(yao)物的(de)開發，其進展都(dou)非常緩慢。
嵌合病(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)是一種基因工程重(zhong)組病(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)，在(zai)(zai)制備(bei)(bei)技(ji)術上并不(bu)存在(zai)(zai)太大(da)問題，但(dan)作為(wei)(wei)重(zhong)組病(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)，在(zai)(zai)安(an)全性(xing)上還(huan)有一定的(de)(de)風(feng)險，在(zai)(zai)自(zi)然條件下(xia)，有病(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)之間自(zi)發產生重(zhong)組的(de)(de)例子(zi)，可能獲得一些(xie)意想(xiang)不(bu)到的(de)(de)新型病(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)，比母體株毒(du)(du)(du)力更(geng)強，對生物體更(geng)具有威脅性(xing)。所以(yi)在(zai)(zai)制備(bei)(bei)嵌合病(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)時，要采用已知特(te)性(xing)的(de)(de)病(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)株作為(wei)(wei)嵌合病(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)的(de)(de)骨架結構(gou)，特(te)別是多(duo)選(xuan)用減毒(du)(du)(du)株作為(wei)(wei)載(zai)體病(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)目前黃熱病(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)的(de)(de)嵌合病(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)采用的(de)(de)載(zai)體主要有以(yi)下(xia)幾種。
YF一(yi)17DD 疫(yi)(yi)苗(miao)(miao)株(zhu)(zhu) YF一(yi)17DD是目前預防黃熱(re)病(bing)(bing)毒(du)感染的(de)(de)一(yi)株(zhu)(zhu)減毒(du)活疫(yi)(yi)苗(miao)(miao)】，始(shi)用于1936年(nian)，在過(guo)去的(de)(de)6O多年(nian)中，有(you)超過(guo)3億人接(jie)種(zhong)(zhong)過(guo)該(gai)疫(yi)(yi)苗(miao)(miao)，安(an)全有(you)效。該(gai)疫(yi)(yi)苗(miao)(miao)株(zhu)(zhu)免(mian)疫(yi)(yi)原性(xing)(xing)很好，單劑量(liang)接(jie)種(zhong)(zhong)后10d內，近(jin)lo0%的(de)(de)接(jie)種(zhong)(zhong)者產生中和(he)抗(kang)體，免(mian)疫(yi)(yi)力(li)持久(jiu)甚(shen)至能夠維持終身(shen)。將YF一(yi)17DD疫(yi)(yi)苗(miao)(miao)株(zhu)(zhu)和(he)原病(bing)(bing)毒(du)株(zhu)(zhu)YF—Asibi進(jin)行序列比較(jiao)后發現，該(gai)病(bing)(bing)毒(du)的(de)(de)抗(kang)原表位多集(ji)中在E基(ji)因(yin)(yin)，構(gou)建(jian)嵌(qian)(qian)合(he)病(bing)(bing)毒(du)多以(yi)這(zhe)一(yi)段基(ji)因(yin)(yin)作為靶(ba)基(ji)因(yin)(yin)。這(zhe)樣構(gou)建(jian)的(de)(de)嵌(qian)(qian)合(he)病(bing)(bing)毒(du)中，由YF一(yi)17DD株(zhu)(zhu)保(bao)(bao)留的(de)(de)NS蛋(dan)白基(ji)因(yin)(yin)只是誘(you)發針對該(gai)蛋(dan)白的(de)(de)CTLs和(he)非中和(he)性(xing)(xing)抗(kang)體，而不具有(you)交叉保(bao)(bao)護性(xing)(xing)，所(suo)以(yi)嵌(qian)(qian)合(he)病(bing)(bing)毒(du)作為疫(yi)(yi)苗(miao)(miao)使用時(shi)不會(hui)引起一(yi)般重組病(bing)(bing)毒(du)帶來(lai)的(de)(de)抗(kang)載體免(mian)疫(yi)(yi)反應，即(ji)使曾經接(jie)種(zhong)(zhong)過(guo)YF一(yi)17DD的(de)(de)接(jie)痘者再接(jie)種(zhong)(zhong)嵌(qian)(qian)合(he)病(bing)(bing)毒(du)也是安(an)全有(you)效的(de)(de)，可以(yi)作為一(yi)個(ge)理想的(de)(de)活疫(yi)(yi)苗(miao)(miao)株(zhu)(zhu)嵌(qian)(qian)合(he)病(bing)(bing)毒(du)載體。1989年(nian)Rice等(deng)151構(gou)建(jian)了YF一(yi)17DD的(de)(de)感染性(xing)(xing)克隆，為構(gou)建(jian)嵌(qian)(qian)合(he)病(bing)(bing)毒(du)提供了方便，目前文(wen)獻中報道(dao)的(de)(de)有(you)關(guan)黃熱(re)病(bing)(bing)毒(du)嵌(qian)(qian)合(he)株(zhu)(zhu)多以(yi)此(ci)病(bing)(bing)毒(du)株(zhu)(zhu)作為載體病(bing)(bing)毒(du)。已(yi)經成功(gong)構(gou)建(jian)了包括JEV、TBE、WNV、DEN等(deng)4個(ge)血清型病(bing)(bing)毒(du)的(de)(de)嵌(qian)(qian)合(he)體。
YF一17DD 疫苗株
DEN一(yi)4變異株(zhu)(zhu) 登(deng)革(ge)病(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)分為(wei)4個血(xue)清型，這4型病(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)結構蛋(dan)白氨基酸序列同源(yuan)性(xing)高達62%-74%，并且它們(men)之間還有很好的(de)交(jiao)叉免(mian)疫(yi)原性(xing)，一(yi)直以(yi)(yi)來，人們(men)試圖構建(jian)登(deng)革(ge)病(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)的(de)4價疫(yi)苗，Bray等從1991年開始登(deng)革(ge)病(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)嵌(qian)(qian)合病(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)的(de)研(yan)究，以(yi)(yi)DEN一(yi)4814669株(zhu)(zhu)全長克(ke)隆(long)作(zuo)為(wei)載體(ti)，構建(jian)了(le)包括DEN—l到DEN一(yi)3的(de)嵌(qian)(qian)合病(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)，結果(guo)發現(xian)幾株(zhu)(zhu)病(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)的(de)毒(du)(du)(du)性(xing)并沒有太大改變，他們(men)認(ren)為(wei)若能夠以(yi)(yi)一(yi)個毒(du)(du)(du)性(xing)低的(de)DEN-4病(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)作(zuo)為(wei)載體(ti)骨架(jia)，可(ke)(ke)能會使(shi)嵌(qian)(qian)合病(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)毒(du)(du)(du)性(xing)下(xia)降(jiang)，由于(yu)3端(duan)和(he)5端(duan)非編碼(ma)區在(zai)病(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)的(de)復制中可(ke)(ke)能也(ye)起到調控作(zuo)用，他們(men)在(zai)構建(jian)的(de)DEN一(yi)4感(gan)染性(xing)克(ke)隆(long)的(de)基礎上(shang)，刪除(chu)其(qi)3端(duan)和(he)5端(duan)非編碼(ma)區的(de)部(bu)分序列，結果(guo)篩選(xuan)到一(yi)株(zhu)(zhu)減(jian)毒(du)(du)(du)株(zhu)(zhu)，其(qi)3端(duan)去掉了(le)3O個核苷(gan)酸，毒(du)(du)(du)性(xing)降(jiang)低但是免(mian)疫(yi)原性(xing)并沒有改變。用這個減(jian)毒(du)(du)(du)株(zhu)(zhu)作(zuo)為(wei)載體(ti)和(he)其(qi)它3個血(xue)清型的(de)登(deng)革(ge)病(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)構成嵌(qian)(qian)合病(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)后，果(guo)然(ran)有效地降(jiang)低了(le)病(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)毒(du)(du)(du)性(xing)；其(qi)后這個載體(ti)也(ye)用于(yu)構建(jian)黃(huang)熱病(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)屬(shu)其(qi)他成員的(de)嵌(qian)(qian)合病(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)。
DEN一4變異株
DEN一(yi)(yi)2 PDK一(yi)(yi)53減(jian)(jian)(jian)(jian)毒(du)(du)株(zhu)(zhu) 該減(jian)(jian)(jian)(jian)毒(du)(du)株(zhu)(zhu)也主要(yao)(yao)(yao)是(shi)用于合(he)成登(deng)革(ge)病(bing)毒(du)(du)的(de)(de)(de)(de)(de)嵌合(he)疫(yi)苗(miao)，2O世紀8O年代(dai)初(chu)期，泰國Mahidol實(shi)驗室將4種血(xue)清型的(de)(de)(de)(de)(de)登(deng)革(ge)病(bing)毒(du)(du)經過(guo)在細胞傳代(dai)中后獲得各(ge)自的(de)(de)(de)(de)(de)減(jian)(jian)(jian)(jian)毒(du)(du)株(zhu)(zhu)，其中以DEN一(yi)(yi)2PDK一(yi)(yi)53減(jian)(jian)(jian)(jian)毒(du)(du)株(zhu)(zhu)減(jian)(jian)(jian)(jian)毒(du)(du)效果最(zui)好，免疫(yi)保護力最(zui)強最(zui)持久。將該減(jian)(jian)(jian)(jian)毒(du)(du)株(zhu)(zhu)和(he)野(ye)生株(zhu)(zhu)進(jin)行(xing)比較，發(fa)現核(he)苷酸水平上的(de)(de)(de)(de)(de)變異主要(yao)(yao)(yao)在非結構(gou)區，說明(ming)該病(bing)毒(du)(du)株(zhu)(zhu)和(he)毒(du)(du)力有(you)關(guan)的(de)(de)(de)(de)(de)基(ji)因可(ke)能在非結構(gou)區，而黃熱病(bing)毒(du)(du)屬其他成員的(de)(de)(de)(de)(de)毒(du)(du)力基(ji)因多(duo)位于E蛋白(bai)，這樣構(gou)建的(de)(de)(de)(de)(de)嵌合(he)病(bing)毒(du)(du)減(jian)(jian)(jian)(jian)毒(du)(du)機制主要(yao)(yao)(yao)由供(gong)體株(zhu)(zhu)的(de)(de)(de)(de)(de)毒(du)(du)性(xing)起(qi)主要(yao)(yao)(yao)因素，而由DEN一(yi)(yi)2PDK-53減(jian)(jian)(jian)(jian)毒(du)(du)株(zhu)(zhu)構(gou)建的(de)(de)(de)(de)(de)嵌合(he)疫(yi)苗(miao)毒(du)(du)性(xing)的(de)(de)(de)(de)(de)減(jian)(jian)(jian)(jian)弱由供(gong)體和(he)受(shou)體共(gong)同(tong)決定，更有(you)利于減(jian)(jian)(jian)(jian)毒(du)(du)株(zhu)(zhu)的(de)(de)(de)(de)(de)獲得
DEN一2 PDK一53減毒株
DEN一(yi)(yi)2減(jian)毒(du)(du)(du)株作為(wei)嵌合(he)病毒(du)(du)(du)的(de)(de)(de)(de)(de)載體還有(you)另外一(yi)(yi)個好處，登(deng)革病毒(du)(du)(du)4個血清(qing)(qing)型(xing)(xing)(xing)之(zhi)間產生交叉免(mian)(mian)疫(yi)(yi)(yi)力，所(suo)以(yi)(yi)異型(xing)(xing)(xing)病毒(du)(du)(du)的(de)(de)(de)(de)(de)二次(ci)感(gan)(gan)染由(you)于抗體依(yi)賴的(de)(de)(de)(de)(de)增強作用可以(yi)(yi)導(dao)(dao)致登(deng)革出血熱(re)/登(deng)革熱(re)休(xiu)克綜(zong)合(he)征(zheng)(DHF/DSS)的(de)(de)(de)(de)(de)發生，理想的(de)(de)(de)(de)(de)登(deng)革4價(jia)疫(yi)(yi)(yi)苗(miao)誘(you)(you)導(dao)(dao)的(de)(de)(de)(de)(de)免(mian)(mian)疫(yi)(yi)(yi)力要針對(dui)4種(zhong)血清(qing)(qing)型(xing)(xing)(xing)病毒(du)(du)(du)，有(you)效而(er)且要持(chi)(chi)久，其(qi)中(zhong)任何(he)一(yi)(yi)種(zhong)血清(qing)(qing)型(xing)(xing)(xing)抗體的(de)(de)(de)(de)(de)消減(jian)都(dou)有(you)發生DHF/DSS的(de)(de)(de)(de)(de)可能。流行病學(xue)資(zi)料表明，DEN幾(ji)個血清(qing)(qing)型(xing)(xing)(xing)感(gan)(gan)染人(ren)的(de)(de)(de)(de)(de)概(gai)率(lv)是不同(tong)的(de)(de)(de)(de)(de)，其(qi)中(zhong)以(yi)(yi)DEN一(yi)(yi)2的(de)(de)(de)(de)(de)感(gan)(gan)染概(gai)率(lv)最高，所(suo)以(yi)(yi)由(you)其(qi)它幾(ji)種(zhong)血清(qing)(qing)型(xing)(xing)(xing)病毒(du)(du)(du)誘(you)(you)發的(de)(de)(de)(de)(de)免(mian)(mian)疫(yi)(yi)(yi)反(fan)(fan)應(ying)很易識(shi)別DEN一(yi)(yi)2病毒(du)(du)(du)，由(you)此(ci)DEN一(yi)(yi)2病毒(du)(du)(du)誘(you)(you)發DHF/DSS的(de)(de)(de)(de)(de)概(gai)率(lv)明顯(xian)大于DEN—l、一(yi)(yi)3、一(yi)(yi)4；另外DEN一(yi)(yi)2病毒(du)(du)(du)誘(you)(you)導(dao)(dao)的(de)(de)(de)(de)(de)特(te)異免(mian)(mian)疫(yi)(yi)(yi)力又(you)明顯(xian)弱于其(qi)它3型(xing)(xing)(xing)，所(suo)以(yi)(yi)制備以(yi)(yi)DEN一(yi)(yi)2為(wei)基礎(chu)的(de)(de)(de)(de)(de)4價(jia)疫(yi)(yi)(yi)苗(miao)和(he)傳統疫(yi)(yi)(yi)苗(miao)比較，減(jian)少(shao)了DEN—l、一(yi)(yi)3、一(yi)(yi)4的(de)(de)(de)(de)(de)4種(zhong)血清(qing)(qing)型(xing)(xing)(xing)NS3蛋白誘(you)(you)發的(de)(de)(de)(de)(de)交叉免(mian)(mian)疫(yi)(yi)(yi)反(fan)(fan)應(ying)之(zhi)間的(de)(de)(de)(de)(de)干(gan)擾作用，減(jian)少(shao)了DHF/DSS的(de)(de)(de)(de)(de)可能，同(tong)時又(you)能有(you)效而(er)持(chi)(chi)久地誘(you)(you)導(dao)(dao)機體產生針對(dui)4種(zhong)血清(qing)(qing)型(xing)(xing)(xing)的(de)(de)(de)(de)(de)免(mian)(mian)疫(yi)(yi)(yi)反(fan)(fan)應(ying)，從而(er)起到(dao)預防作用。
克隆(long)法 嵌(qian)(qian)合(he)病(bing)(bing)毒(du)的獲得(de)大多是利(li)用感染性克隆(long)技(ji)術(shu)(shu)，目前(qian)已有(you)(you)部(bu)分黃熱病(bing)(bing)毒(du)屬病(bing)(bing)毒(du)獲得(de)了感染性克隆(long)，如YFV、TBEV、Kunjin病(bing)(bing)毒(du)、墨累(lei)河谷(gu)腦炎病(bing)(bing)毒(du)(MVE)、西尼(ni)羅河病(bing)(bing)毒(du)(WNV)、DEN4型(xing)病(bing)(bing)毒(du)，這些克隆(long)包含有(you)(you)病(bing)(bing)毒(du)的全(quan)部(bu)基因，能夠在宿主菌中穩定地復制(zhi)和傳(chuan)代(dai)，以(yi)作(zuo)(zuo)為種子批保存。當(dang)構建嵌(qian)(qian)合(he)體(ti)(ti)時(shi)，在供(gong)體(ti)(ti)基因和受體(ti)(ti)基因的連(lian)接處，通過同(tong)義突變(bian)或者保守突變(bian)，為受體(ti)(ti)株(zhu)和供(gong)體(ti)(ti)株(zhu)基因組添加合(he)適的酶(mei)切(qie)位點(dian)，然(ran)后(hou)將兩(liang)者利(li)用酶(mei)切(qie)位點(dian)連(lian)接起(qi)來(lai)，制(zhi)備嵌(qian)(qian)合(he)性克隆(long)，體(ti)(ti)外經RNA聚合(he)酶(mei)作(zuo)(zuo)用轉錄出嵌(qian)(qian)合(he)性轉錄子，轉染細胞后(hou)重新(xin)獲得(de)嵌(qian)(qian)合(he)病(bing)(bing)毒(du)。這項(xiang)技(ji)術(shu)(shu)的一個優點(dian)在于(yu)在它是在cDNA水平上的操作(zuo)(zuo)，突變(bian)率低、表型(xing)穩定，不像傳(chuan)統疫苗研制(zhi)過程中容易發生一系列的生物特性改變(bian)。
克隆法
融合(he)(he)PCR 利(li)用PCR技術(shu)制(zhi)備嵌(qian)合(he)(he)病毒最大的優(you)點在(zai)于方便快捷，過去幾(ji)個月的工作現在(zai)幾(ji)天就能完成。目前生物技術(shu)產(chan)品日臻(zhen)完善，不少公司推出高保真、熱穩(wen)定性好的逆轉錄酶(mei)(mei)(mei)和DNA聚合(he)(he)酶(mei)(mei)(mei)，如SuperscriptII逆轉錄酶(mei)(mei)(mei)、LAro~酶(mei)(mei)(mei)、Exraq酶(mei)(mei)(mei)、ExpandlongtemplatePCR聚合(he)(he)酶(mei)(mei)(mei)系(xi)統等，利(li)用這些酶(mei)(mei)(mei)可以(yi)有(you)效地擴(kuo)增出病毒基因(yin)組(zu)大片段(>5kh)甚至全長的cDNA。用4條引(yin)物、3次PCR可以(yi)把兩個異質基因(yin)片段連接在(zai)一起(qi)。另(ling)有(you)報(bao)道利(li)用3個引(yin)物、兩次PCR即可制(zhi)備嵌(qian)合(he)(he)基因(yin)，如YF—MOD嵌(qian)合(he)(he)病毒。
融合PCR
與(yu)克(ke)(ke)隆技術相比較，PCR方法更為靈活，可以選擇任意位(wei)置(zhi)進行嵌合；但是PCR具有一(yi)定的突變率(lv)，可能會帶來一(yi)些致死性(xing)突變而(er)使轉錄體不(bu)(bu)具有感(gan)染性(xing)，得不(bu)(bu)到(dao)恢(hui)復病毒從而(er)前功盡棄，所(suo)以現在(zai)大多數(shu)實(shi)驗還(huan)是采取克(ke)(ke)隆法。
滅活(huo)(huo)(huo)(huo)病(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)之間(jian)的(de)(de)(de)基因(yin)重(zhong)組 是將兩(liang)種或(huo)者(zhe)兩(liang)種以(yi)(yi)上的(de)(de)(de)滅活(huo)(huo)(huo)(huo)病(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)，在(zai)同一細胞內培養后(hou)，它們之間(jian)發(fa)生(sheng)基因(yin)重(zhong)組，有(you)時會產生(sheng)感(gan)染性(xing)病(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)，這種方法(fa)又(you)(you)稱(cheng)為多重(zhong)復合，可能(neng)(neng)由于滅活(huo)(huo)(huo)(huo)病(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)受損的(de)(de)(de)基因(yin)經(jing)重(zhong)組后(hou)得以(yi)(yi)替補。如為了解包膜病(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)的(de)(de)(de)融合活(huo)(huo)(huo)(huo)性(xing)，利用(yong)黃熱(re)病(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)YF一17DD和(he)(he)流感(gan)病(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)X31兩(liang)者(zhe)不(bu)(bu)同的(de)(de)(de)融合條件(jian)，以(yi)(yi)及核衣(yi)殼不(bu)(bu)同的(de)(de)(de)形態，將YF一17DD通過酸處理失去融合活(huo)(huo)(huo)(huo)性(xing)，X31通過熱(re)處理滅活(huo)(huo)(huo)(huo)，兩(liang)者(zhe)在(zai)YF一17DD滅活(huo)(huo)(huo)(huo)的(de)(de)(de)同一pH值下發(fa)生(sheng)融和(he)(he)反應，只有(you)發(fa)生(sheng)融和(he)(he)反應的(de)(de)(de)嵌合病(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)具有(you)感(gan)染性(xing)；流感(gan)病(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)提供功(gong)(gong)(gong)能(neng)(neng)型膜蛋白融合成分，YF一17DD提供功(gong)(gong)(gong)能(neng)(neng)基因(yin)組，結果兩(liang)個(ge)滅活(huo)(huo)(huo)(huo)病(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)又(you)(you)重(zhong)新構建成新的(de)(de)(de)病(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)。這項(xiang)技(ji)術隨機性(xing)很大，但是可能(neng)(neng)得到意(yi)想(xiang)不(bu)(bu)到的(de)(de)(de)結果，可以(yi)(yi)用(yong)于病(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)功(gong)(gong)(gong)能(neng)(neng)的(de)(de)(de)研究。
黃熱(re)病(bing)毒(du)嵌(qian)(qian)合(he)病(bing)毒(du)的(de)構(gou)(gou)(gou)建前提在(zai)于，所有(you)的(de)黃熱(re)病(bing)毒(du)的(de)病(bing)毒(du)基(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)組(zu)的(de)結(jie)構(gou)(gou)(gou)是高度保守的(de)，它們(men)均為(wei)(wei)單股(gu)正鏈RNA病(bing)毒(du)，基(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)組(zu)全長約(yue)l1kb，5端有(you)帽子結(jie)構(gou)(gou)(gou)，3端無poly(A)尾(wei)，一(yi)個(ge)長的(de)開放閱讀框架覆蓋(gai)了大部(bu)分基(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)組(zu)，共編(bian)碼3個(ge)結(jie)構(gou)(gou)(gou)蛋白(bai)和7個(ge)非結(jie)構(gou)(gou)(gou)蛋白(bai)，其中(zhong)以(yi)E蛋白(bai)和免疫原性關系最為(wei)(wei)密切，所以(yi)構(gou)(gou)(gou)建的(de)嵌(qian)(qian)合(he)病(bing)毒(du)一(yi)般都(dou)要取(qu)供體病(bing)毒(du)的(de)E基(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)；但并不是所有(you)構(gou)(gou)(gou)建的(de)嵌(qian)(qian)合(he)性cDNA克隆都(dou)具有(you)感染性，其主要影響因(yin)(yin)(yin)素如下。
技(ji)術(shu)方面 雖然現在(zai)工具酶的保(bao)真性(xing)和(he)效率越來(lai)越好，但是(shi)黃(huang)熱病毒長10kb以上，在(zai)基因(yin)操作中(zhong)不(bu)可避免有(you)(you)突(tu)變的發生，而有(you)(you)些(xie)突(tu)變是(shi)致死性(xing)突(tu)變，使得構(gou)建的全長cDNA克隆(long)或(huo)者嵌(qian)合體克隆(long)沒(mei)有(you)(you)感(gan)染性(xing)。另外(wai)這(zhe)些(xie)突(tu)變還影響恢復病毒的生物學特性(xing)，如溫(wen)度(du)敏感(gan)性(xing)、噬(shi)斑大小(xiao)、復制(zhi)能(neng)力、嗜細胞能(neng)力都(dou)可能(neng)發生改變。
技術方面
嵌(qian)合(he)位(wei)(wei)(wei)(wei)點(dian)(dian)(dian)(dian) 結(jie)構蛋(dan)(dan)白(bai)基因(yin)之(zhi)間(jian)的(de)連(lian)接處(chu)(chu)(chu)有一(yi)(yi)段(duan)(duan)親脂(zhi)區(qu)序(xu)(xu)列(lie)，是構建嵌(qian)合(he)病(bing)毒(du)時將兩(liang)(liang)段(duan)(duan)異(yi)質核苷酸序(xu)(xu)列(lie)進(jin)行連(lian)接的(de)嵌(qian)合(he)位(wei)(wei)(wei)(wei)點(dian)(dian)(dian)(dian)處(chu)(chu)(chu)，這一(yi)(yi)段(duan)(duan)序(xu)(xu)列(lie)的(de)保守性對于嵌(qian)合(he)病(bing)毒(du)的(de)復制(zhi)能力至關重要。如在(zai)prM和(he)C基因(yin)之(zhi)間(jian)有信(xin)號肽(tai)酶(mei)(mei)(mei)切(qie)割(ge)(ge)位(wei)(wei)(wei)(wei)點(dian)(dian)(dian)(dian)以及蛋(dan)(dan)白(bai)酶(mei)(mei)(mei)切(qie)割(ge)(ge)位(wei)(wei)(wei)(wei)點(dian)(dian)(dian)(dian)，Cau—four等在(zai)構建YF17D—DEN2嵌(qian)合(he)病(bing)毒(du)時選擇這兩(liang)(liang)處(chu)(chu)(chu)作為嵌(qian)合(he)位(wei)(wei)(wei)(wei)點(dian)(dian)(dian)(dian)，結(jie)果在(zai)信(xin)號肽(tai)酶(mei)(mei)(mei)切(qie)割(ge)(ge)位(wei)(wei)(wei)(wei)點(dian)(dian)(dian)(dian)處(chu)(chu)(chu)嵌(qian)合(he)的(de)病(bing)毒(du)有感染性，而在(zai)蛋(dan)(dan)白(bai)酶(mei)(mei)(mei)切(qie)割(ge)(ge)位(wei)(wei)(wei)(wei)點(dian)(dian)(dian)(dian)處(chu)(chu)(chu)進(jin)行連(lian)接無法獲得病(bing)毒(du)，因(yin)為在(zai)兩(liang)(liang)個位(wei)(wei)(wei)(wei)點(dian)(dian)(dian)(dian)之(zhi)間(jian)有一(yi)(yi)段(duan)(duan)親脂(zhi)性的(de)轉膜區(qu)，YFv這一(yi)(yi)區(qu)域比DEN一(yi)(yi)2該區(qu)域要多6個氨基酸；在(zai)蛋(dan)(dan)白(bai)酶(mei)(mei)(mei)切(qie)割(ge)(ge)位(wei)(wei)(wei)(wei)點(dian)(dian)(dian)(dian)處(chu)(chu)(chu)構建的(de)嵌(qian)合(he)體，由于這一(yi)(yi)轉膜區(qu)缺少了6個氨基酸，蛋(dan)(dan)白(bai)酶(mei)(mei)(mei)和(he)信(xin)號肽(tai)酶(mei)(mei)(mei)不能正確識(shi)別(bie)切(qie)割(ge)(ge)位(wei)(wei)(wei)(wei)點(dian)(dian)(dian)(dian)，從而影(ying)響prM蛋(dan)(dan)白(bai)和(he)E蛋(dan)(dan)白(bai)的(de)成(cheng)熟，病(bing)毒(du)的(de)復制(zhi)過程受到阻礙，病(bing)毒(du)顆粒沒法進(jin)行正常的(de)包裝，所以無法分泌出病(bing)毒(du)顆粒。
嵌合位點
供(gong)體(ti)(ti)病(bing)毒(du)(du)(du)(du)基因(yin) 目前構(gou)建(jian)的(de)(de)嵌(qian)合病(bing)毒(du)(du)(du)(du)多(duo)為供(gong)體(ti)(ti)株提供(gong)P和(he)(he)E基因(yin)，人(ren)們也(ye)(ye)嘗(chang)試過替代C基因(yin)或者部分(fen)基因(yin)，但多(duo)數沒(mei)有(you)成功(gong)，其可(ke)能的(de)(de)原(yuan)因(yin)是位(wei)于C蛋(dan)白區域的(de)(de)保守序列(lie)與受體(ti)(ti)株病(bing)毒(du)(du)(du)(du)順式結構(gou)不相容性，進而對嵌(qian)合病(bing)毒(du)(du)(du)(du)RNA的(de)(de)復制(zhi)(zhi)產生了(le)毒(du)(du)(du)(du)性，如Kuniin病(bing)毒(du)(du)(du)(du)RNA復制(zhi)(zhi)必須有(you)同源C蛋(dan)白上的(de)(de)第2位(wei)和(he)(he)第20位(wei)氨(an)基酸的(de)(de)存，而異質基因(yin)的(de)(de)C蛋(dan)白不能協(xie)助Kunjin病(bing)毒(du)(du)(du)(du)復制(zhi)(zhi)，所以無(wu)法(fa)長成病(bing)毒(du)(du)(du)(du)顆粒；另(ling)外也(ye)(ye)可(ke)能是異質病(bing)毒(du)(du)(du)(du)之間(jian)的(de)(de)蛋(dan)白酶識別對方序列(lie)的(de)(de)能力(li)低下，對于C—prM部位(wei)的(de)(de)切割效率(lv)低，影響病(bing)毒(du)(du)(du)(du)正常的(de)(de)裝配和(he)(he)釋放(fang)能力(li)。
供體病毒
受體(ti)病毒(du)基(ji)(ji)因(yin)(yin) 作為嵌(qian)(qian)合(he)(he)病毒(du)載體(ti)，嵌(qian)(qian)合(he)(he)病毒(du)中(zhong)的(de)大部(bu)分(fen)(fen)基(ji)(ji)因(yin)(yin)由(you)受體(ti)株(zhu)提供，嵌(qian)(qian)合(he)(he)病毒(du)的(de)復制特性(xing)也主要由(you)受體(ti)株(zhu)的(de)基(ji)(ji)因(yin)(yin)控制，其中(zhong)有(you)(you)些序(xu)(xu)列(lie)(lie)對(dui)于嵌(qian)(qian)合(he)(he)體(ti)的(de)感染性(xing)有(you)(you)決定性(xing)作用，在(zai)構建(jian)嵌(qian)(qian)合(he)(he)體(ti)時(shi)，如(ru)果這(zhe)部(bu)分(fen)(fen)序(xu)(xu)列(lie)(lie)受到破(po)壞，就(jiu)不能夠獲得恢復病毒(du)。如(ru)在(zai)構建(jian)DEN一(yi)4和(he)WNV的(de)嵌(qian)(qian)合(he)(he)病毒(du)時(shi)四，由(you)WNVNY99的(de)prM和(he)E基(ji)(ji)因(yin)(yin)代替DEN一(yi)4相(xiang)應(ying)位(wei)置的(de)基(ji)(ji)因(yin)(yin)，在(zai)構建(jian)的(de)18個(ge)克隆(long)(long)中(zhong)僅有(you)(you)兩個(ge)具有(you)(you)感染性(xing)，序(xu)(xu)列(lie)(lie)比較(jiao)發現這(zhe)兩個(ge)克隆(long)(long)在(zai)prM和(he)C蛋白之間的(de)NS2A—NS2B蛋白酶切(qie)割位(wei)點(dian)下游，在(zai)轉(zhuan)膜信號(hao)區域中(zhong)都包含一(yi)基(ji)(ji)序(xu)(xu)，這(zhe)一(yi)基(ji)(ji)序(xu)(xu)是酶切(qie)割位(wei)點(dian)下游的(de)第(di)3位(wei)及第(di)6位(wei)分(fen)(fen)別為天冬(dong)氨(an)酸(suan)和(he)蘇氨(an)酸(suan)，另外16個(ge)克隆(long)(long)則沒有(you)(you)該位(wei)點(dian)，實驗(yan)表(biao)明這(zhe)兩個(ge)位(wei)點(dian)似乎和(he)嵌(qian)(qian)合(he)(he)性(xing)克隆(long)(long)的(de)感染性(xing)有(you)(you)關(guan)。
受體病毒
嵌(qian)合(he)病(bing)毒的(de)一個(ge)最(zui)大(da)特點是表型多發生(sheng)變化，如復制能(neng)力(li)、毒力(li)、抗原性等(deng)，可(ke)能(neng)的(de)原因(yin)(yin)(yin)是由(you)于(yu)缺乏校正功能(neng)的(de)聚(ju)合(he)酶存在(zai)，而有異質基因(yin)(yin)(yin)的(de)正鏈RNA病(bing)毒，在(zai)病(bing)毒復制中具有較(jiao)高的(de)基因(yin)(yin)(yin)突(tu)變率(lv)，并(bing)且這些(xie)突(tu)變為了適應不(bu)同(tong)的(de)宿(su)主細(xi)胞，可(ke)能(neng)會發生(sheng)一些(xie)特性改變，從而出現(xian)一些(xie)預想(xiang)不(bu)到(dao)的(de)結果。
生長(chang)特(te)性改變 嵌(qian)合(he)病毒的(de)兩個母體病毒的(de)易感細胞(bao)不同，得(de)到的(de)嵌(qian)合(he)病毒在不同細胞(bao)中(zhong)復制(zhi)(zhi)時，由于缺乏有效的(de)復制(zhi)(zhi)酶而引(yin)起生長(chang)特(te)性的(de)改變，其(qi)嗜細胞(bao)性也會有所改變，另外噬斑試驗中(zhong)噬斑形(xing)態
生長特性改變
大小(xiao)都多(duo)有變化。如Chimeri—JE嵌合(he)體(ti)在(zai)(zai)Vero、LLC—MK，、C6/36細(xi)胞(bao)(bao)中(zhong)復制形(xing)式類似，而在(zai)(zai)MRC一(yi)5、FRhl細(xi)胞(bao)(bao)中(zhong)雖(sui)然病毒(du)(du)滴度能(neng)(neng)夠達到(dao)6log。0pfu/mL，但是卻(que)不(bu)能(neng)(neng)產(chan)生CPE，這些特(te)性(xing)和(he)母體(ti)株YFV以及JEV都截(jie)然不(bu)同。LGT1和(he)E5是TBEV的(de)兩個(ge)弱毒(du)(du)株，與DEN一(yi)4病毒(du)(du)組(zu)成的(de)嵌合(he)體(ti)在(zai)(zai)猿(yuan)猴細(xi)胞(bao)(bao)中(zhong)復制能(neng)(neng)力(li)下降，而轉染蚊蟲細(xi)胞(bao)(bao)復制能(neng)(neng)力(li)不(bu)受影響，用在(zai)(zai)蚊蟲細(xi)胞(bao)(bao)傳代的(de)嵌合(he)病毒(du)(du)在(zai)(zai)猿(yuan)猴細(xi)胞(bao)(bao)LLC—MK2中(zhong)不(bu)能(neng)(neng)夠形(xing)成噬(shi)斑，而在(zai)(zai)早期構建的(de)DEN一(yi)4和(he)另一(yi)個(ge)TBEV病毒(du)(du)株構建的(de)嵌合(he)體(ti)在(zai)(zai)猿(yuan)猴細(xi)胞(bao)(bao)中(zhong)卻(que)能(neng)(neng)夠得到(dao)比DEN一(yi)4病毒(du)(du)滴度高1000倍的(de)嵌合(he)病毒(du)(du)。
神(shen)(shen)經(jing)內(nei)毒(du)(du)(du)(du)(du)性(xing)和神(shen)(shen)經(jing)外毒(du)(du)(du)(du)(du)性(xing) 神(shen)(shen)經(jing)內(nei)(外)毒(du)(du)(du)(du)(du)性(xing)低而免疫原(yuan)性(xing)好(hao)是一(yi)個理想(xiang)疫苗應具(ju)備的(de)(de)品(pin)質，許多實驗室經(jing)過多年(nian)研(yan)究雖然篩檢出(chu)一(yi)些(xie)(xie)減(jian)毒(du)(du)(du)(du)(du)株(zhu)，但(dan)是兩者多不(bu)能(neng)達(da)到(dao)有效的(de)(de)統(tong)一(yi)。嵌合(he)(he)病(bing)(bing)毒(du)(du)(du)(du)(du)技術以“取長補短”的(de)(de)原(yuan)則，將兩種(zhong)病(bing)(bing)毒(du)(du)(du)(du)(du)的(de)(de)免疫原(yuan)性(xing)和毒(du)(du)(du)(du)(du)性(xing)結合(he)(he)起來，以期研(yan)制(zhi)理想(xiang)疫苗，就目前(qian)得(de)到(dao)的(de)(de)一(yi)些(xie)(xie)嵌合(he)(he)株(zhu)來說(shuo)，確實取得(de)了(le)一(yi)些(xie)(xie)令人滿意的(de)(de)結果(guo)，如DEN一(yi)4和WNV的(de)(de)嵌合(he)(he)病(bing)(bing)毒(du)(du)(du)(du)(du)與WNV相比高度減(jian)毒(du)(du)(du)(du)(du)四，腦內(nei)接(jie)種(zhong)戒(jie)奶小(xiao)鼠(shu)，神(shen)(shen)經(jing)內(nei)毒(du)(du)(du)(du)(du)性(xing)降(jiang)低至(zhi)1/28500；腹腔內(nei)接(jie)種(zhong)小(xiao)鼠(shu)，神(shen)(shen)經(jing)外毒(du)(du)(du)(du)(du)性(xing)下降(jiang)至(zhi)1/10000，免疫原(yuan)性(xing)好(hao)，能(neng)安全保護(hu)小(xiao)鼠(shu)接(jie)受野生株(zhu)攻擊。另(ling)外如ChimeriVax—JE嵌合(he)(he)病(bing)(bing)毒(du)(du)(du)(du)(du)毒(du)(du)(du)(du)(du)性(xing)也較母體株(zhu)YFV和JEV呈大(da)幅度下降(jiang)，而單劑(ji)量又具(ju)備很好(hao)的(de)(de)免疫保護(hu)力；還有DEN—TBEV、YFV-DEN、YFV—WNV等(deng)嵌合(he)(he)病(bing)(bing)毒(du)(du)(du)(du)(du)株(zhu)的(de)(de)毒(du)(du)(du)(du)(du)性(xing)都有所下降(jiang)，這些(xie)(xie)嵌合(he)(he)體都在進一(yi)步(bu)的(de)(de)研(yan)究中。
神經內毒性和神經外毒性
基(ji)因(yin)(yin)穩(wen)定(ding)(ding)性(xing) 因(yin)(yin)為RNA病(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)易(yi)以準種的(de)(de)形式出現(xian)和(he)易(yi)變(bian)異的(de)(de)特性(xing)，作為活(huo)疫苗來使用(yong)，一個重要的(de)(de)條(tiao)件是(shi)基(ji)因(yin)(yin)型要穩(wen)定(ding)(ding)，這一點是(shi)疫苗安全性(xing)的(de)(de)重要表現(xian)。嵌合(he)(he)病(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)的(de)(de)穩(wen)定(ding)(ding)性(xing)主(zhu)(zhu)要通(tong)過(guo)(guo)返祖實驗檢定(ding)(ding)，即在(zai)(zai)(zai)乳(ru)(ru)鼠(shu)腦內(nei)(nei)和(he)細胞(bao)(bao)中(zhong)進(jin)(jin)行(xing)(xing)培養(yang)，觀察有無(wu)明(ming)顯表型變(bian)化，必要時(shi)(shi)(shi)進(jin)(jin)行(xing)(xing)核(he)苷酸鑒(jian)定(ding)(ding)，如ChimeriVax-JE嵌合(he)(he)病(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)115．161在(zai)(zai)(zai)細胞(bao)(bao)內(nei)(nei)傳代(dai)l8次以及在(zai)(zai)(zai)乳(ru)(ru)鼠(shu)腦內(nei)(nei)傳代(dai)6次并(bing)沒(mei)有毒(du)(du)(du)力的(de)(de)回升，對減毒(du)(du)(du)位(wei)點進(jin)(jin)行(xing)(xing)測(ce)序(xu)也(ye)沒(mei)有發生(sheng)核(he)苷酸改(gai)變(bian)。而有的(de)(de)嵌合(he)(he)病(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)穩(wen)定(ding)(ding)性(xing)不夠好如DEN一2/DEN一4、DEN一2/DEN—l復(fu)制(zhi)能力較弱，而經(jing)過(guo)(guo)幾次傳代(dai)后(hou)得到較高的(de)(de)病(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)滴度，是(shi)因(yin)(yin)為發生(sheng)了(le)一些(xie)突變(bian)。在(zai)(zai)(zai)體外轉(zhuan)錄(lu)時(shi)(shi)(shi)產生(sheng)了(le)轉(zhuan)錄(lu)體的(de)(de)雜(za)和(he)體，在(zai)(zai)(zai)轉(zhuan)染(ran)后(hou)經(jing)過(guo)(guo)細胞(bao)(bao)復(fu)制(zhi)，復(fu)制(zhi)能力增強的(de)(de)病(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)逐漸占(zhan)主(zhu)(zhu)要優勢，在(zai)(zai)(zai)LLC—MK2細胞(bao)(bao)中(zhong)病(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)傳代(dai)可以保(bao)持較高的(de)(de)遺(yi)傳穩(wen)定(ding)(ding)性(xing)，所以在(zai)(zai)(zai)制(zhi)備嵌合(he)(he)疫苗時(shi)(shi)(shi)，應盡量減少病(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)在(zai)(zai)(zai)哺乳(ru)(ru)動物細胞(bao)(bao)中(zhong)傳代(dai)的(de)(de)次數。
基因穩定性
在黃熱病(bing)毒(du)嵌合病(bing)毒(du)發展的(de)這十幾年中，人(ren)們嘗試構建了多(duo)種(zhong)嵌合病(bing)毒(du)，其中大部分(fen)是(shi)以制(zhi)備疫苗為目的(de)，另外還用(yong)于病(bing)毒(du)的(de)分(fen)子生物學特性研究。
分子生物學特性(xing)研(yan)究 型內嵌合病(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)可(ke)以用于了(le)解病(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)復制(zhi)(zhi)能(neng)(neng)力，進一(yi)步了(le)解各基因的(de)(de)功能(neng)(neng)。如構(gou)建(jian)同(tong)型不(bu)同(tong)株(zhu)(zhu)之(zhi)間(jian)(jian)DEN一(yi)216681/PDK一(yi)53、DEN25ol/04株(zhu)(zhu)之(zhi)間(jian)(jian)的(de)(de)型內嵌合疫(yi)苗，研(yan)究DEN一(yi)2型病(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)結構(gou)蛋白(bai)區對乳(ru)鼠神經毒(du)性(xing)的(de)(de)影(ying)響。可(ke)以用于推測病(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)毒(du)力位(wei)點，由(you)2個(ge)JEV病(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)株(zhu)(zhu)cDNA克隆提供5端(duan)，3個(ge)病(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)株(zhu)(zhu)cDNA提供的(de)(de)3端(duan)進行(xing)組(zu)合，感染(ran)細(xi)胞后(hou)重新獲得6種(zhong)重組(zu)JEV病(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)。根據噬菌斑(ban)大(da)小篩選(xuan)到3個(ge)減毒(du)株(zhu)(zhu)，比(bi)較(jiao)(jiao)6種(zhong)重組(zu)病(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)株(zhu)(zhu)和野(ye)生株(zhu)(zhu)的(de)(de)基因序列，發現僅(jin)僅(jin)是(shi)(shi)E138(Glu—Lys)一(yi)個(ge)氨(an)基酸位(wei)點不(bu)同(tong)，說明這(zhe)個(ge)位(wei)點和毒(du)力之(zhi)間(jian)(jian)關系密切(qie)；另外發現該突(tu)變(bian)株(zhu)(zhu)雖然毒(du)性(xing)降低(di)，但(dan)是(shi)(shi)腦(nao)內注(zhu)射接(jie)種(zhong)小鼠后(hou)仍能(neng)(neng)在腦(nao)內復制(zhi)(zhi)，但(dan)是(shi)(shi)病(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)滴(di)度比(bi)較(jiao)(jiao)低(di)，看來(lai)其減毒(du)機制(zhi)(zhi)不(bu)在于病(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)的(de)(de)復制(zhi)(zhi)，而可(ke)能(neng)(neng)是(shi)(shi)影(ying)響復制(zhi)(zhi)的(de)(de)早期機制(zhi)(zhi)，在細(xi)胞之(zhi)間(jian)(jian)傳遞速度比(bi)較(jiao)(jiao)慢，從而使免疫(yi)系統(tong)能(neng)(neng)及時清除病(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)。
分子(zi)生物學(xue)特(te)性研究
型間(jian)嵌(qian)合病(bing)(bing)毒(du)也可以用(yong)于(yu)分子生(sheng)(sheng)物學(xue)(xue)特(te)(te)性的(de)研究(jiu)，如黃熱(re)病(bing)(bing)毒(du)和日本腦炎(yan)病(bing)(bing)毒(du)雖然同(tong)(tong)屬黃熱(re)病(bing)(bing)毒(du)屬，但是(shi)有很多(duo)生(sheng)(sheng)物學(xue)(xue)特(te)(te)性都(dou)不盡相(xiang)同(tong)(tong)，如抗原性相(xiang)差(cha)很遠、中間(jian)宿主不同(tong)(tong)、引起人體發病(bing)(bing)的(de)癥狀也截然不同(tong)(tong)；兩者雖然從同(tong)(tong)一病(bing)(bing)毒(du)得來(lai)，但是(shi)在進化的(de)過程中發生(sheng)(sheng)了很大的(de)變化，構(gou)建的(de)嵌(qian)合病(bing)(bing)毒(du)YF/JE(S)其生(sheng)(sheng)物學(xue)(xue)特(te)(te)性也有所(suo)(suo)改(gai)變，如神經內毒(du)性和神經外毒(du)性都(dou)有所(suo)(suo)降(jiang)低，和其供體株(zhu)SAl4一l4—2相(xiang)似(si)；而構(gou)建的(de)另一個(ge)嵌(qian)合株(zhu)YF/JE(N)神經毒(du)性卻很高(gao)，和供體株(zhu)Nakayama特(te)(te)性一致；這說明確實如原先預料，和減(jian)毒(du)有關的(de)表位主要存在E蛋(dan)白中，而同(tong)(tong)時(shi)也發現，和原來(lai)的(de)SA14-14-2相(xiang)比較(jiao)，嵌(qian)合株(zhu)在細胞中復制能力(li)升高(gao)，病(bing)(bing)毒(du)滴(di)度(du)較(jiao)高(gao)，免疫原性增加(jia)，這又說明是(shi)YF一17DD病(bing)(bing)毒(du)的(de)非結構(gou)蛋(dan)白發揮(hui)作(zuo)用(yong)。
候選疫苗 ChimeriVax-JE嵌合病毒
候選疫苗
日(ri)本腦(nao)炎(yan)是一(yi)(yi)種(zhong)影(ying)響中(zhong)樞神(shen)經系統的(de)(de)(de)疾病(bing)，主(zhu)要流(liu)行于亞(ya)洲，但是近年(nian)在澳洲、美洲也有(you)病(bing)例(li)發生，每年(nian)官(guan)方(fang)報道全(quan)球有(you)5萬病(bing)例(li)，其中(zhong)有(you)l萬例(li)是致死性的(de)(de)(de)；雖然目前有(you)活(huo)疫(yi)苗(miao)(miao)、滅活(huo)疫(yi)苗(miao)(miao)的(de)(de)(de)使用(yong)(yong)，但是這(zhe)些(xie)疫(yi)苗(miao)(miao)具(ju)有(you)免疫(yi)原性不夠(gou)(gou)、價格偏高、制作工藝不被WHO認可(ke)等(deng)劣勢，所以(yi)還有(you)必要開(kai)發研制新疫(yi)苗(miao)(miao)。1999年(nian)Chambers等(deng)以(yi)SA14-14-2的(de)(de)(de)prM和E基(ji)因代替YF一(yi)(yi)17DD疫(yi)苗(miao)(miao)株的(de)(de)(de)相應基(ji)因構建(jian)了嵌(qian)(qian)合(he)(he)病(bing)毒(du)ChimeriVax—JE15,16,，該病(bing)毒(du)能在WHO認可(ke)的(de)(de)(de)細(xi)胞中(zhong)很好地被培養，恢復病(bing)毒(du)和YF一(yi)(yi)17DD、SA14—14-2相比較，以(yi)6log0pfu的(de)(de)(de)嵌(qian)(qian)合(he)(he)病(bing)毒(du)腦(nao)內(nei)接種(zhong)3-4周(zhou)齡(ling)小鼠無一(yi)(yi)例(li)發病(bing)，而接種(zhong)YF-17DD的(de)(de)(de)小鼠全(quan)部死亡；另(ling)外用(yong)(yong)3．2log0pfu劑量的(de)(de)(de)SA14-14-2接種(zhong)，能在85%一(yi)(yi)95%的(de)(de)(de)接種(zhong)者中(zhong)產生中(zhong)和抗(kang)體(ti)，抗(kang)體(ti)平均滴度能夠(gou)(gou)達到(dao)PRNT~o<30，血(xue)清(qing)陽轉(zhuan)率(lv)(lv)小于80%；而接種(zhong)4~51og0pfu的(de)(de)(de)嵌(qian)(qian)合(he)(he)疫(yi)苗(miao)(miao)后，能夠(gou)(gou)達到(dao)100%的(de)(de)(de)血(xue)清(qing)陽轉(zhuan)率(lv)(lv)，接種(zhong)后30dPRNT能夠(gou)(gou)達到(dao)129~327，這(zhe)些(xie)結果(guo)表明構建(jian)的(de)(de)(de)嵌(qian)(qian)合(he)(he)病(bing)毒(du)神(shen)經內(nei)毒(du)性呈大幅(fu)度降(jiang)低；用(yong)(yong)乳鼠以(yi)及猴(hou)子(zi)進行安全(quan)試驗檢(jian)測(ce)，進一(yi)(yi)步證實了該病(bing)毒(du)的(de)(de)(de)弱(ruo)神(shen)經毒(du)性，內(nei)臟毒(du)性也下降(jiang)。目前該疫(yi)苗(miao)(miao)已經通過(guo)一(yi)(yi)期臨床試驗，是很有(you)前途的(de)(de)(de)疫(yi)苗(miao)(miao)候(hou)選株。
登(deng)革(ge)病毒多價疫苗
登(deng)革(ge)病(bing)毒(du)是目(mu)前(qian)誘發疾病(bing)最多(duo)的(de)黃熱(re)病(bing)毒(du)，在人口聚(ju)集(ji)的(de)熱(re)帶及亞熱(re)帶時有爆發，因為登(deng)革(ge)病(bing)毒(du)4個(ge)血清型之間可(ke)以產(chan)生交叉保護力，所(suo)以感(gan)染(ran)一(yi)種(zhong)病(bing)毒(du)后，能夠(gou)對(dui)另外3種(zhong)血清型病(bing)毒(du)的(de)抗體反應。在機(ji)體遭受另一(yi)種(zhong)血清型病(bing)毒(du)的(de)感(gan)染(ran)后，由(you)于(yu)抗體依賴的(de)復制(zhi)能力增強作(zuo)用(yong)可(ke)能誘發DHF/DSS的(de)發生，因此(ci)理想的(de)疫(yi)(yi)苗應該能夠(gou)產(chan)生針對(dui)4個(ge)型病(bing)毒(du)的(de)中和(he)抗體和(he)T細(xi)胞免疫(yi)(yi)。目(mu)前(qian)主(zhu)要(yao)有兩個(ge)實驗(yan)室(shi)分別以DEN一(yi)2PDK一(yi)53和(he)YF一(yi)17DD作(zuo)為受體株(zhu)構建(jian)了包括DEN一(yi)1到(dao)DEN-4型的(de)嵌合株(zhu)，結果(guo)有很好的(de)免疫(yi)(yi)原性、較高的(de)復制(zhi)效率和(he)穩(wen)定性，在動物實驗(yan)中證明毒(du)性減低(di)，小鼠效力實驗(yan)安全有效，有望成為登(deng)革(ge)病(bing)毒(du)疫(yi)(yi)苗的(de)發展方向。
另外還有(you)YF/TBE、YF/WNV、DEN4/TBE的報道，都出(chu)現一些令人(ren)滿意(yi)(yi)的特性(xing)，進一步研(yan)究正在(zai)進行中。嵌(qian)合(he)病毒(du)(du)的出(chu)現是(shi)獲得減(jian)毒(du)(du)活疫苗的一個新(xin)途徑，和傳統(tong)方(fang)法相比具有(you)目標(biao)明確、免疫效果(guo)好(hao)、減(jian)毒(du)(du)穩定的優(you)勢，但該技術(shu)目前還處(chu)于(yu)探(tan)索階段，有(you)時(shi)結(jie)果(guo)很出(chu)人(ren)意(yi)(yi)料，所以在(zai)構建一個新(xin)的嵌(qian)合(he)體時(shi)，要時(shi)刻注意(yi)(yi)安全性(xing)問題(ti)，否(fou)則會適得其反(fan)，創造(zao)出(chu)新(xin)的毒(du)(du)性(xing)更(geng)強的病毒(du)(du)，為人(ren)類(lei)帶來危害(hai)。
嵌合疫苗是應用基(ji)因(yin)工程手段(duan)構(gou)建基(ji)因(yin)能表達兩種以上病(bing)(bing)(bing)原(yuan)體抗原(yuan)的一(yi)類(lei)新型疫苗,應用嵌合疫苗可(ke)解(jie)決(jue)多次接(jie)種問題(ti)。本文綜述(shu)了目(mu)前(qian)(qian)世界一(yi)些國家(jia)研制的嵌合疫苗,如登革病(bing)(bing)(bing)毒(du)、乙型腦炎病(bing)(bing)(bing)毒(du)、呼吸道合胞病(bing)(bing)(bing)毒(du)、副(fu)流(liu)感病(bing)(bing)(bing)毒(du)、人類(lei)免疫缺陷病(bing)(bing)(bing)病(bing)(bing)(bing)毒(du)及人乳頭(tou)瘤病(bing)(bing)(bing)毒(du)等相關嵌合疫苗的研究策(ce)略和方法、免疫學評價(jia)及其應用前(qian)(qian)景。
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