黃熱病(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)屬(1qav/virus)包含80多個成員(yuan),屬于正鏈RNA病(bing)(bing)(bing)毒(du)(du),其(qi)中(zhong)半(ban)數以(yi)上的病(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)能夠誘發(fa)人和動(dong)物產(chan)生疾病(bing)(bing)(bing),患病(bing)(bing)(bing)率高而治(zhi)愈率低,容(rong)易(yi)留下一些(xie)嚴重的后遺癥,給人類健(jian)康帶來(lai)很大威(wei)脅,如流行性(xing)乙型(xing)腦炎病(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(JEV)、登(deng)革熱病(bing)(bing)(bing)病(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(DEN)、黃熱病(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(YFV)、蜱傳腦炎病(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(TBEV)等。一直以(yi)來(lai)人們(men)對RNA病(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)的了(le)解(jie)都比較缺乏,無論是分子水平上的機理研究(jiu),還是宏觀上疫苗的研制、藥物的開發(fa),其(qi)進展都非常(chang)緩慢。
嵌(qian)(qian)合(he)病(bing)毒(du)(du)是(shi)一種(zhong)基因(yin)工程重(zhong)組(zu)病(bing)毒(du)(du),在制備技術(shu)上并不(bu)存在太大問題,但作(zuo)為(wei)(wei)重(zhong)組(zu)病(bing)毒(du)(du),在安全性(xing)上還有(you)(you)一定的風(feng)險(xian),在自然條件下,有(you)(you)病(bing)毒(du)(du)之間自發產生重(zhong)組(zu)的例子,可能獲得一些意想不(bu)到(dao)的新型病(bing)毒(du)(du),比(bi)母體株毒(du)(du)力更(geng)強,對生物體更(geng)具(ju)有(you)(you)威脅性(xing)。所以在制備嵌(qian)(qian)合(he)病(bing)毒(du)(du)時,要采用已(yi)知(zhi)特(te)性(xing)的病(bing)毒(du)(du)株作(zuo)為(wei)(wei)嵌(qian)(qian)合(he)病(bing)毒(du)(du)的骨(gu)架結構,特(te)別是(shi)多選用減毒(du)(du)株作(zuo)為(wei)(wei)載體病(bing)毒(du)(du)目前黃熱(re)病(bing)毒(du)(du)的嵌(qian)(qian)合(he)病(bing)毒(du)(du)采用的載體主要有(you)(you)以下幾種(zhong)。
YF一(yi)(yi)17DD 疫(yi)(yi)苗(miao)(miao)株(zhu)(zhu) YF一(yi)(yi)17DD是目前(qian)預防黃(huang)熱(re)病(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)(du)感染的(de)(de)(de)(de)一(yi)(yi)株(zhu)(zhu)減毒(du)(du)(du)(du)活疫(yi)(yi)苗(miao)(miao)】,始用(yong)于1936年(nian),在(zai)過去的(de)(de)(de)(de)6O多(duo)年(nian)中(zhong),有(you)超過3億(yi)人接(jie)(jie)(jie)種(zhong)過該(gai)(gai)疫(yi)(yi)苗(miao)(miao),安全有(you)效(xiao)。該(gai)(gai)疫(yi)(yi)苗(miao)(miao)株(zhu)(zhu)免(mian)疫(yi)(yi)原性(xing)很(hen)好(hao),單(dan)劑量接(jie)(jie)(jie)種(zhong)后(hou)10d內,近lo0%的(de)(de)(de)(de)接(jie)(jie)(jie)種(zhong)者產生中(zhong)和(he)抗(kang)體(ti)(ti)(ti),免(mian)疫(yi)(yi)力持久甚至能夠維持終(zhong)身。將(jiang)YF一(yi)(yi)17DD疫(yi)(yi)苗(miao)(miao)株(zhu)(zhu)和(he)原病(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)(du)株(zhu)(zhu)YF—Asibi進行(xing)序列比較(jiao)后(hou)發現(xian),該(gai)(gai)病(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)(du)的(de)(de)(de)(de)抗(kang)原表位多(duo)集中(zhong)在(zai)E基(ji)(ji)因(yin),構(gou)建(jian)嵌(qian)合(he)病(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)(du)多(duo)以這一(yi)(yi)段基(ji)(ji)因(yin)作為靶基(ji)(ji)因(yin)。這樣構(gou)建(jian)的(de)(de)(de)(de)嵌(qian)合(he)病(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)(du)中(zhong),由YF一(yi)(yi)17DD株(zhu)(zhu)保留的(de)(de)(de)(de)NS蛋白基(ji)(ji)因(yin)只(zhi)是誘發針對該(gai)(gai)蛋白的(de)(de)(de)(de)CTLs和(he)非(fei)中(zhong)和(he)性(xing)抗(kang)體(ti)(ti)(ti),而不具有(you)交叉保護(hu)性(xing),所以嵌(qian)合(he)病(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)(du)作為疫(yi)(yi)苗(miao)(miao)使用(yong)時不會引(yin)起一(yi)(yi)般重組病(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)(du)帶來的(de)(de)(de)(de)抗(kang)載(zai)(zai)體(ti)(ti)(ti)免(mian)疫(yi)(yi)反應,即使曾經接(jie)(jie)(jie)種(zhong)過YF一(yi)(yi)17DD的(de)(de)(de)(de)接(jie)(jie)(jie)痘者再接(jie)(jie)(jie)種(zhong)嵌(qian)合(he)病(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)(du)也是安全有(you)效(xiao)的(de)(de)(de)(de),可以作為一(yi)(yi)個理想的(de)(de)(de)(de)活疫(yi)(yi)苗(miao)(miao)株(zhu)(zhu)嵌(qian)合(he)病(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)(du)載(zai)(zai)體(ti)(ti)(ti)。1989年(nian)Rice等151構(gou)建(jian)了(le)(le)YF一(yi)(yi)17DD的(de)(de)(de)(de)感染性(xing)克隆,為構(gou)建(jian)嵌(qian)合(he)病(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)(du)提供了(le)(le)方便,目前(qian)文獻中(zhong)報(bao)道的(de)(de)(de)(de)有(you)關黃(huang)熱(re)病(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)(du)嵌(qian)合(he)株(zhu)(zhu)多(duo)以此病(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)(du)株(zhu)(zhu)作為載(zai)(zai)體(ti)(ti)(ti)病(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)(du)。已(yi)經成功(gong)構(gou)建(jian)了(le)(le)包(bao)括JEV、TBE、WNV、DEN等4個血清(qing)型病(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)(du)的(de)(de)(de)(de)嵌(qian)合(he)體(ti)(ti)(ti)。
YF一17DD 疫苗株
DEN一(yi)(yi)4變(bian)異株(zhu)(zhu) 登革病(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)(du)(du)(du)(du)(du)分(fen)為(wei)4個(ge)血清(qing)(qing)型,這(zhe)4型病(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)(du)(du)(du)(du)(du)結(jie)構(gou)(gou)蛋白氨基酸(suan)序(xu)列同源(yuan)性高(gao)達62%-74%,并且(qie)它(ta)們之(zhi)間還有很(hen)好的(de)(de)(de)交(jiao)叉免疫原(yuan)(yuan)性,一(yi)(yi)直以(yi)來(lai),人們試圖構(gou)(gou)建登革病(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)(du)(du)(du)(du)(du)的(de)(de)(de)4價疫苗,Bray等(deng)從1991年開始登革病(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)(du)(du)(du)(du)(du)嵌(qian)合病(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)(du)(du)(du)(du)(du)的(de)(de)(de)研究,以(yi)DEN一(yi)(yi)4814669株(zhu)(zhu)全長克隆作為(wei)載(zai)體(ti),構(gou)(gou)建了包括DEN—l到DEN一(yi)(yi)3的(de)(de)(de)嵌(qian)合病(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)(du)(du)(du)(du)(du),結(jie)果發現(xian)幾株(zhu)(zhu)病(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)(du)(du)(du)(du)(du)的(de)(de)(de)毒(du)(du)(du)(du)(du)(du)(du)(du)性并沒有太大改變(bian),他們認為(wei)若能(neng)夠以(yi)一(yi)(yi)個(ge)毒(du)(du)(du)(du)(du)(du)(du)(du)性低的(de)(de)(de)DEN-4病(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)(du)(du)(du)(du)(du)作為(wei)載(zai)體(ti)骨架,可能(neng)會使(shi)嵌(qian)合病(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)(du)(du)(du)(du)(du)毒(du)(du)(du)(du)(du)(du)(du)(du)性下降,由于3端(duan)和(he)5端(duan)非編(bian)碼(ma)區在病(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)(du)(du)(du)(du)(du)的(de)(de)(de)復(fu)制中可能(neng)也(ye)起到調控作用,他們在構(gou)(gou)建的(de)(de)(de)DEN一(yi)(yi)4感染性克隆的(de)(de)(de)基礎上(shang),刪除(chu)其3端(duan)和(he)5端(duan)非編(bian)碼(ma)區的(de)(de)(de)部分(fen)序(xu)列,結(jie)果篩選到一(yi)(yi)株(zhu)(zhu)減毒(du)(du)(du)(du)(du)(du)(du)(du)株(zhu)(zhu),其3端(duan)去掉了3O個(ge)核苷(gan)酸(suan),毒(du)(du)(du)(du)(du)(du)(du)(du)性降低但(dan)是免疫原(yuan)(yuan)性并沒有改變(bian)。用這(zhe)個(ge)減毒(du)(du)(du)(du)(du)(du)(du)(du)株(zhu)(zhu)作為(wei)載(zai)體(ti)和(he)其它(ta)3個(ge)血清(qing)(qing)型的(de)(de)(de)登革病(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)(du)(du)(du)(du)(du)構(gou)(gou)成嵌(qian)合病(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)(du)(du)(du)(du)(du)后(hou),果然(ran)有效地降低了病(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)(du)(du)(du)(du)(du)毒(du)(du)(du)(du)(du)(du)(du)(du)性;其后(hou)這(zhe)個(ge)載(zai)體(ti)也(ye)用于構(gou)(gou)建黃熱(re)病(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)(du)(du)(du)(du)(du)屬其他成員的(de)(de)(de)嵌(qian)合病(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)(du)(du)(du)(du)(du)。
DEN一4變異(yi)株
DEN一(yi)2 PDK一(yi)53減(jian)(jian)(jian)(jian)毒(du)(du)株(zhu)(zhu) 該(gai)減(jian)(jian)(jian)(jian)毒(du)(du)株(zhu)(zhu)也主要(yao)是用于(yu)合(he)成(cheng)(cheng)登革(ge)(ge)病(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)的(de)(de)嵌合(he)疫苗,2O世紀(ji)8O年代(dai)初(chu)期,泰國Mahidol實驗室將4種血(xue)清型的(de)(de)登革(ge)(ge)病(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)經(jing)過在(zai)細胞(bao)傳代(dai)中后獲(huo)得各自的(de)(de)減(jian)(jian)(jian)(jian)毒(du)(du)株(zhu)(zhu),其中以DEN一(yi)2PDK一(yi)53減(jian)(jian)(jian)(jian)毒(du)(du)株(zhu)(zhu)減(jian)(jian)(jian)(jian)毒(du)(du)效果最(zui)好,免疫保(bao)護力最(zui)強最(zui)持(chi)久。將該(gai)減(jian)(jian)(jian)(jian)毒(du)(du)株(zhu)(zhu)和野生株(zhu)(zhu)進行比(bi)較,發現核苷酸水(shui)平上的(de)(de)變異主要(yao)在(zai)非(fei)結構(gou)區,說明該(gai)病(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)株(zhu)(zhu)和毒(du)(du)力有關(guan)的(de)(de)基因(yin)可能在(zai)非(fei)結構(gou)區,而(er)黃熱病(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)屬(shu)其他(ta)成(cheng)(cheng)員的(de)(de)毒(du)(du)力基因(yin)多位于(yu)E蛋白,這樣構(gou)建的(de)(de)嵌合(he)病(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)減(jian)(jian)(jian)(jian)毒(du)(du)機制主要(yao)由(you)供體株(zhu)(zhu)的(de)(de)毒(du)(du)性(xing)起主要(yao)因(yin)素(su),而(er)由(you)DEN一(yi)2PDK-53減(jian)(jian)(jian)(jian)毒(du)(du)株(zhu)(zhu)構(gou)建的(de)(de)嵌合(he)疫苗毒(du)(du)性(xing)的(de)(de)減(jian)(jian)(jian)(jian)弱由(you)供體和受體共同決定,更(geng)有利于(yu)減(jian)(jian)(jian)(jian)毒(du)(du)株(zhu)(zhu)的(de)(de)獲(huo)得
DEN一2 PDK一53減毒(du)株
DEN一(yi)(yi)2減(jian)毒(du)株(zhu)作(zuo)(zuo)為(wei)嵌合病(bing)(bing)毒(du)的(de)(de)載(zai)體還有(you)另外一(yi)(yi)個好處,登(deng)革病(bing)(bing)毒(du)4個血(xue)(xue)清(qing)(qing)型(xing)之(zhi)間產生(sheng)交叉免(mian)疫(yi)力(li),所(suo)以(yi)異型(xing)病(bing)(bing)毒(du)的(de)(de)二次感染由于抗體依賴(lai)的(de)(de)增(zeng)強(qiang)作(zuo)(zuo)用可以(yi)導(dao)致登(deng)革出(chu)血(xue)(xue)熱/登(deng)革熱休克綜合征(zheng)(DHF/DSS)的(de)(de)發(fa)生(sheng),理(li)想的(de)(de)登(deng)革4價疫(yi)苗(miao)誘(you)(you)導(dao)的(de)(de)免(mian)疫(yi)力(li)要針對4種(zhong)(zhong)(zhong)血(xue)(xue)清(qing)(qing)型(xing)病(bing)(bing)毒(du),有(you)效而(er)(er)且要持(chi)(chi)久,其(qi)中任何一(yi)(yi)種(zhong)(zhong)(zhong)血(xue)(xue)清(qing)(qing)型(xing)抗體的(de)(de)消(xiao)減(jian)都有(you)發(fa)生(sheng)DHF/DSS的(de)(de)可能。流(liu)行病(bing)(bing)學資料表明,DEN幾(ji)個血(xue)(xue)清(qing)(qing)型(xing)感染人的(de)(de)概(gai)率是不(bu)同的(de)(de),其(qi)中以(yi)DEN一(yi)(yi)2的(de)(de)感染概(gai)率最高,所(suo)以(yi)由其(qi)它(ta)幾(ji)種(zhong)(zhong)(zhong)血(xue)(xue)清(qing)(qing)型(xing)病(bing)(bing)毒(du)誘(you)(you)發(fa)的(de)(de)免(mian)疫(yi)反應很易識別DEN一(yi)(yi)2病(bing)(bing)毒(du),由此DEN一(yi)(yi)2病(bing)(bing)毒(du)誘(you)(you)發(fa)DHF/DSS的(de)(de)概(gai)率明顯(xian)大于DEN—l、一(yi)(yi)3、一(yi)(yi)4;另外DEN一(yi)(yi)2病(bing)(bing)毒(du)誘(you)(you)導(dao)的(de)(de)特(te)異免(mian)疫(yi)力(li)又明顯(xian)弱于其(qi)它(ta)3型(xing),所(suo)以(yi)制備以(yi)DEN一(yi)(yi)2為(wei)基礎的(de)(de)4價疫(yi)苗(miao)和傳(chuan)統疫(yi)苗(miao)比(bi)較,減(jian)少了DEN—l、一(yi)(yi)3、一(yi)(yi)4的(de)(de)4種(zhong)(zhong)(zhong)血(xue)(xue)清(qing)(qing)型(xing)NS3蛋(dan)白誘(you)(you)發(fa)的(de)(de)交叉免(mian)疫(yi)反應之(zhi)間的(de)(de)干擾作(zuo)(zuo)用,減(jian)少了DHF/DSS的(de)(de)可能,同時又能有(you)效而(er)(er)持(chi)(chi)久地誘(you)(you)導(dao)機體產生(sheng)針對4種(zhong)(zhong)(zhong)血(xue)(xue)清(qing)(qing)型(xing)的(de)(de)免(mian)疫(yi)反應,從而(er)(er)起到(dao)預(yu)防作(zuo)(zuo)用。
克(ke)隆法 嵌合病(bing)毒的獲得(de)大(da)多是利用感染(ran)性(xing)(xing)克(ke)隆技(ji)術(shu),目前已有(you)部分黃熱病(bing)毒屬(shu)病(bing)毒獲得(de)了感染(ran)性(xing)(xing)克(ke)隆,如YFV、TBEV、Kunjin病(bing)毒、墨累河谷腦炎病(bing)毒(MVE)、西尼(ni)羅河病(bing)毒(WNV)、DEN4型(xing)病(bing)毒,這(zhe)些克(ke)隆包含有(you)病(bing)毒的全部基(ji)因(yin),能夠在(zai)宿主菌中穩(wen)定地(di)復制(zhi)和傳(chuan)代,以作(zuo)為(wei)種子批保存。當構(gou)建嵌合體(ti)(ti)時(shi),在(zai)供體(ti)(ti)基(ji)因(yin)和受(shou)體(ti)(ti)基(ji)因(yin)的連接處,通過(guo)同義突變(bian)或者保守突變(bian),為(wei)受(shou)體(ti)(ti)株和供體(ti)(ti)株基(ji)因(yin)組添加合適的酶(mei)切位點,然后(hou)將(jiang)兩者利用酶(mei)切位點連接起來(lai),制(zhi)備(bei)嵌合性(xing)(xing)克(ke)隆,體(ti)(ti)外經(jing)RNA聚合酶(mei)作(zuo)用轉錄出嵌合性(xing)(xing)轉錄子,轉染(ran)細胞后(hou)重新獲得(de)嵌合病(bing)毒。這(zhe)項技(ji)術(shu)的一個優點在(zai)于在(zai)它(ta)是在(zai)cDNA水平(ping)上的操作(zuo),突變(bian)率低、表型(xing)穩(wen)定,不像傳(chuan)統疫苗研(yan)制(zhi)過(guo)程中容(rong)易發生(sheng)(sheng)一系列的生(sheng)(sheng)物(wu)特性(xing)(xing)改(gai)變(bian)。
克隆法
融合(he)(he)PCR 利(li)用(yong)PCR技術(shu)制(zhi)(zhi)備(bei)嵌(qian)(qian)合(he)(he)病(bing)(bing)毒最大的(de)(de)優點在于方便快捷,過去幾個(ge)(ge)月的(de)(de)工作現(xian)在幾天就能完成。目前生物技術(shu)產品日臻完善,不少(shao)公司推(tui)出(chu)高保真、熱(re)穩定性好的(de)(de)逆(ni)轉(zhuan)(zhuan)錄(lu)酶(mei)(mei)和DNA聚(ju)(ju)合(he)(he)酶(mei)(mei),如SuperscriptII逆(ni)轉(zhuan)(zhuan)錄(lu)酶(mei)(mei)、LAro~酶(mei)(mei)、Exraq酶(mei)(mei)、ExpandlongtemplatePCR聚(ju)(ju)合(he)(he)酶(mei)(mei)系統等,利(li)用(yong)這些酶(mei)(mei)可(ke)以(yi)有效(xiao)地擴增出(chu)病(bing)(bing)毒基因組大片段(>5kh)甚至全長的(de)(de)cDNA。用(yong)4條引(yin)物、3次(ci)PCR可(ke)以(yi)把(ba)兩個(ge)(ge)異質基因片段連接在一起。另有報道利(li)用(yong)3個(ge)(ge)引(yin)物、兩次(ci)PCR即(ji)可(ke)制(zhi)(zhi)備(bei)嵌(qian)(qian)合(he)(he)基因,如YF—MOD嵌(qian)(qian)合(he)(he)病(bing)(bing)毒。
融合PCR
與克隆(long)技術(shu)相比較,PCR方法(fa)更(geng)為靈(ling)活,可(ke)以(yi)(yi)選(xuan)擇任意位(wei)置進行嵌合(he);但是(shi)(shi)PCR具有一定(ding)的突變(bian)率,可(ke)能會帶來(lai)一些(xie)致死(si)性突變(bian)而(er)使轉錄體不具有感染性,得不到恢復(fu)病毒從而(er)前功盡棄,所以(yi)(yi)現在大多數實驗還是(shi)(shi)采取克隆(long)法(fa)。
滅(mie)活(huo)病(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)(du)(du)之間(jian)的(de)(de)基因(yin)重(zhong)(zhong)組(zu)(zu) 是將(jiang)兩(liang)種或(huo)者兩(liang)種以上的(de)(de)滅(mie)活(huo)病(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)(du)(du),在(zai)同一(yi)(yi)(yi)細胞(bao)內(nei)培養后,它們(men)之間(jian)發(fa)生(sheng)(sheng)(sheng)基因(yin)重(zhong)(zhong)組(zu)(zu),有時會產生(sheng)(sheng)(sheng)感染(ran)性(xing)病(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)(du)(du),這(zhe)種方法又(you)稱(cheng)為(wei)多重(zhong)(zhong)復合(he)(he)(he),可能(neng)(neng)由于滅(mie)活(huo)病(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)(du)(du)受(shou)損的(de)(de)基因(yin)經重(zhong)(zhong)組(zu)(zu)后得(de)(de)以替補(bu)。如(ru)為(wei)了解包膜病(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)(du)(du)的(de)(de)融合(he)(he)(he)活(huo)性(xing),利用(yong)黃(huang)熱病(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)(du)(du)YF一(yi)(yi)(yi)17DD和(he)流感病(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)(du)(du)X31兩(liang)者不(bu)同的(de)(de)融合(he)(he)(he)條(tiao)件(jian),以及核衣殼不(bu)同的(de)(de)形態,將(jiang)YF一(yi)(yi)(yi)17DD通過(guo)酸處理失去融合(he)(he)(he)活(huo)性(xing),X31通過(guo)熱處理滅(mie)活(huo),兩(liang)者在(zai)YF一(yi)(yi)(yi)17DD滅(mie)活(huo)的(de)(de)同一(yi)(yi)(yi)pH值(zhi)下發(fa)生(sheng)(sheng)(sheng)融和(he)反應(ying),只有發(fa)生(sheng)(sheng)(sheng)融和(he)反應(ying)的(de)(de)嵌(qian)合(he)(he)(he)病(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)(du)(du)具有感染(ran)性(xing);流感病(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)(du)(du)提(ti)供功(gong)能(neng)(neng)型膜蛋白融合(he)(he)(he)成(cheng)分,YF一(yi)(yi)(yi)17DD提(ti)供功(gong)能(neng)(neng)基因(yin)組(zu)(zu),結果兩(liang)個滅(mie)活(huo)病(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)(du)(du)又(you)重(zhong)(zhong)新(xin)構建成(cheng)新(xin)的(de)(de)病(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)(du)(du)。這(zhe)項技術隨機性(xing)很大,但是可能(neng)(neng)得(de)(de)到意想不(bu)到的(de)(de)結果,可以用(yong)于病(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)(du)(du)功(gong)能(neng)(neng)的(de)(de)研究。
黃熱病(bing)(bing)毒(du)嵌(qian)合病(bing)(bing)毒(du)的(de)構建前提(ti)在于,所有(you)的(de)黃熱病(bing)(bing)毒(du)的(de)病(bing)(bing)毒(du)基因組(zu)(zu)(zu)的(de)結構是高度保(bao)守的(de),它們均為單(dan)股(gu)正鏈RNA病(bing)(bing)毒(du),基因組(zu)(zu)(zu)全長約(yue)l1kb,5端有(you)帽子結構,3端無poly(A)尾,一(yi)個長的(de)開放閱讀框(kuang)架(jia)覆蓋(gai)了大部分基因組(zu)(zu)(zu),共編碼3個結構蛋(dan)白(bai)(bai)和7個非結構蛋(dan)白(bai)(bai),其(qi)中以E蛋(dan)白(bai)(bai)和免(mian)疫原(yuan)性關系最(zui)為密切(qie),所以構建的(de)嵌(qian)合病(bing)(bing)毒(du)一(yi)般都要(yao)取供(gong)體病(bing)(bing)毒(du)的(de)E基因;但并不是所有(you)構建的(de)嵌(qian)合性cDNA克隆(long)都具有(you)感染性,其(qi)主要(yao)影(ying)響因素如下。
技術方面 雖然現在工具酶的保(bao)真性(xing)(xing)和(he)效率(lv)越來越好,但是黃熱病毒長10kb以(yi)上,在基因操作(zuo)中不(bu)可避免有(you)突(tu)(tu)變(bian)的發生(sheng)(sheng),而有(you)些突(tu)(tu)變(bian)是致死性(xing)(xing)突(tu)(tu)變(bian),使(shi)得構建的全長cDNA克(ke)隆(long)或者嵌合體克(ke)隆(long)沒有(you)感染性(xing)(xing)。另外這些突(tu)(tu)變(bian)還(huan)影響恢復(fu)病毒的生(sheng)(sheng)物學(xue)特性(xing)(xing),如溫度敏感性(xing)(xing)、噬斑大小(xiao)、復(fu)制能(neng)(neng)力(li)、嗜細胞(bao)能(neng)(neng)力(li)都可能(neng)(neng)發生(sheng)(sheng)改變(bian)。
技術方面
嵌(qian)合(he)位(wei)(wei)(wei)點(dian)(dian) 結構(gou)(gou)蛋(dan)(dan)白基(ji)因(yin)之(zhi)(zhi)間(jian)的(de)(de)連接(jie)(jie)處有(you)(you)一(yi)(yi)(yi)段(duan)(duan)親脂(zhi)區(qu)(qu)序列(lie),是(shi)構(gou)(gou)建嵌(qian)合(he)病毒(du)(du)時(shi)(shi)將兩(liang)段(duan)(duan)異質核苷(gan)酸(suan)序列(lie)進(jin)行(xing)連接(jie)(jie)的(de)(de)嵌(qian)合(he)位(wei)(wei)(wei)點(dian)(dian)處,這(zhe)一(yi)(yi)(yi)段(duan)(duan)序列(lie)的(de)(de)保守性(xing)對于(yu)嵌(qian)合(he)病毒(du)(du)的(de)(de)復(fu)制能力至關(guan)重要(yao)。如在prM和C基(ji)因(yin)之(zhi)(zhi)間(jian)有(you)(you)信(xin)號肽酶(mei)(mei)切(qie)割位(wei)(wei)(wei)點(dian)(dian)以(yi)及蛋(dan)(dan)白酶(mei)(mei)切(qie)割位(wei)(wei)(wei)點(dian)(dian),Cau—four等在構(gou)(gou)建YF17D—DEN2嵌(qian)合(he)病毒(du)(du)時(shi)(shi)選擇這(zhe)兩(liang)處作為嵌(qian)合(he)位(wei)(wei)(wei)點(dian)(dian),結果(guo)在信(xin)號肽酶(mei)(mei)切(qie)割位(wei)(wei)(wei)點(dian)(dian)處嵌(qian)合(he)的(de)(de)病毒(du)(du)有(you)(you)感(gan)染性(xing),而在蛋(dan)(dan)白酶(mei)(mei)切(qie)割位(wei)(wei)(wei)點(dian)(dian)處進(jin)行(xing)連接(jie)(jie)無法獲得(de)病毒(du)(du),因(yin)為在兩(liang)個位(wei)(wei)(wei)點(dian)(dian)之(zhi)(zhi)間(jian)有(you)(you)一(yi)(yi)(yi)段(duan)(duan)親脂(zhi)性(xing)的(de)(de)轉(zhuan)膜區(qu)(qu),YFv這(zhe)一(yi)(yi)(yi)區(qu)(qu)域(yu)(yu)比(bi)DEN一(yi)(yi)(yi)2該區(qu)(qu)域(yu)(yu)要(yao)多6個氨基(ji)酸(suan);在蛋(dan)(dan)白酶(mei)(mei)切(qie)割位(wei)(wei)(wei)點(dian)(dian)處構(gou)(gou)建的(de)(de)嵌(qian)合(he)體,由于(yu)這(zhe)一(yi)(yi)(yi)轉(zhuan)膜區(qu)(qu)缺少了6個氨基(ji)酸(suan),蛋(dan)(dan)白酶(mei)(mei)和信(xin)號肽酶(mei)(mei)不能正確識別切(qie)割位(wei)(wei)(wei)點(dian)(dian),從而影響(xiang)prM蛋(dan)(dan)白和E蛋(dan)(dan)白的(de)(de)成熟,病毒(du)(du)的(de)(de)復(fu)制過程受(shou)到阻(zu)礙(ai),病毒(du)(du)顆(ke)粒(li)沒法進(jin)行(xing)正常的(de)(de)包裝,所以(yi)無法分泌出病毒(du)(du)顆(ke)粒(li)。
嵌合位點
供體(ti)病(bing)(bing)毒(du)(du)基(ji)(ji)因(yin) 目前(qian)構(gou)建的(de)嵌合病(bing)(bing)毒(du)(du)多為供體(ti)株提供P和(he)E基(ji)(ji)因(yin),人們也嘗試過替代C基(ji)(ji)因(yin)或(huo)者(zhe)部(bu)分基(ji)(ji)因(yin),但(dan)多數(shu)沒有(you)成功,其可能(neng)(neng)的(de)原因(yin)是位(wei)于(yu)C蛋(dan)白(bai)區域(yu)的(de)保守序列與受體(ti)株病(bing)(bing)毒(du)(du)順(shun)式結(jie)構(gou)不(bu)(bu)相容性,進而對(dui)嵌合病(bing)(bing)毒(du)(du)RNA的(de)復制(zhi)(zhi)產(chan)生了(le)毒(du)(du)性,如Kuniin病(bing)(bing)毒(du)(du)RNA復制(zhi)(zhi)必須有(you)同源C蛋(dan)白(bai)上的(de)第2位(wei)和(he)第20位(wei)氨基(ji)(ji)酸的(de)存,而異質基(ji)(ji)因(yin)的(de)C蛋(dan)白(bai)不(bu)(bu)能(neng)(neng)協助Kunjin病(bing)(bing)毒(du)(du)復制(zhi)(zhi),所以無(wu)法長(chang)成病(bing)(bing)毒(du)(du)顆(ke)粒(li);另外(wai)也可能(neng)(neng)是異質病(bing)(bing)毒(du)(du)之間的(de)蛋(dan)白(bai)酶(mei)識別對(dui)方序列的(de)能(neng)(neng)力低下,對(dui)于(yu)C—prM部(bu)位(wei)的(de)切割效率低,影響病(bing)(bing)毒(du)(du)正(zheng)常的(de)裝配(pei)和(he)釋放能(neng)(neng)力。
供體病毒
受(shou)體病(bing)毒基(ji)因 作為嵌(qian)(qian)(qian)(qian)合(he)(he)(he)(he)病(bing)毒載體,嵌(qian)(qian)(qian)(qian)合(he)(he)(he)(he)病(bing)毒中的(de)(de)大部(bu)分(fen)基(ji)因由受(shou)體株提供,嵌(qian)(qian)(qian)(qian)合(he)(he)(he)(he)病(bing)毒的(de)(de)復(fu)制特(te)性(xing)也主(zhu)要(yao)由受(shou)體株的(de)(de)基(ji)因控制,其中有(you)些(xie)序(xu)列對于(yu)嵌(qian)(qian)(qian)(qian)合(he)(he)(he)(he)體的(de)(de)感(gan)染(ran)性(xing)有(you)決(jue)定性(xing)作用(yong),在(zai)(zai)構(gou)建嵌(qian)(qian)(qian)(qian)合(he)(he)(he)(he)體時,如(ru)果這(zhe)部(bu)分(fen)序(xu)列受(shou)到破壞,就(jiu)不能(neng)夠獲得恢復(fu)病(bing)毒。如(ru)在(zai)(zai)構(gou)建DEN一4和(he)WNV的(de)(de)嵌(qian)(qian)(qian)(qian)合(he)(he)(he)(he)病(bing)毒時四,由WNVNY99的(de)(de)prM和(he)E基(ji)因代替DEN一4相應位(wei)(wei)置的(de)(de)基(ji)因,在(zai)(zai)構(gou)建的(de)(de)18個克隆(long)(long)中僅有(you)兩個具有(you)感(gan)染(ran)性(xing),序(xu)列比(bi)較發現這(zhe)兩個克隆(long)(long)在(zai)(zai)prM和(he)C蛋白之間的(de)(de)NS2A—NS2B蛋白酶切(qie)割(ge)位(wei)(wei)點下游,在(zai)(zai)轉膜(mo)信號區域中都包含一基(ji)序(xu),這(zhe)一基(ji)序(xu)是(shi)酶切(qie)割(ge)位(wei)(wei)點下游的(de)(de)第3位(wei)(wei)及(ji)第6位(wei)(wei)分(fen)別(bie)為天冬氨酸和(he)蘇(su)氨酸,另外16個克隆(long)(long)則沒有(you)該位(wei)(wei)點,實(shi)驗表明這(zhe)兩個位(wei)(wei)點似乎和(he)嵌(qian)(qian)(qian)(qian)合(he)(he)(he)(he)性(xing)克隆(long)(long)的(de)(de)感(gan)染(ran)性(xing)有(you)關。
受體病毒
嵌合(he)病毒(du)(du)的(de)一(yi)個最(zui)大特點是(shi)表型多發(fa)生(sheng)變化,如復(fu)制能力(li)(li)、毒(du)(du)力(li)(li)、抗原(yuan)(yuan)性(xing)等,可能的(de)原(yuan)(yuan)因是(shi)由于缺乏校正(zheng)功能的(de)聚合(he)酶存在(zai),而有異質基因的(de)正(zheng)鏈RNA病毒(du)(du),在(zai)病毒(du)(du)復(fu)制中(zhong)具有較高的(de)基因突(tu)變率,并(bing)且(qie)這(zhe)些(xie)(xie)突(tu)變為了適應不(bu)同的(de)宿主細胞,可能會(hui)發(fa)生(sheng)一(yi)些(xie)(xie)特性(xing)改變,從(cong)而出現一(yi)些(xie)(xie)預想不(bu)到的(de)結果。
生長特性(xing)改(gai)變(bian) 嵌合病(bing)毒(du)的(de)(de)兩個母體病(bing)毒(du)的(de)(de)易感(gan)細胞(bao)不同,得到的(de)(de)嵌合病(bing)毒(du)在不同細胞(bao)中復(fu)制時(shi),由于缺乏有(you)效的(de)(de)復(fu)制酶而引起生長特性(xing)的(de)(de)改(gai)變(bian),其嗜(shi)細胞(bao)性(xing)也會(hui)有(you)所改(gai)變(bian),另外噬斑(ban)試驗中噬斑(ban)形態
生長特性改變
大(da)小(xiao)都多有變(bian)化。如Chimeri—JE嵌(qian)合(he)(he)體在(zai)(zai)(zai)(zai)Vero、LLC—MK,、C6/36細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)中(zhong)復(fu)制形式類似,而在(zai)(zai)(zai)(zai)MRC一(yi)(yi)5、FRhl細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)中(zhong)雖然(ran)病(bing)毒(du)滴度能(neng)夠(gou)達到6log。0pfu/mL,但(dan)是(shi)卻(que)不(bu)能(neng)產(chan)生CPE,這(zhe)些(xie)特性和(he)母體株(zhu)YFV以及JEV都截然(ran)不(bu)同。LGT1和(he)E5是(shi)TBEV的兩個(ge)弱毒(du)株(zhu),與(yu)DEN一(yi)(yi)4病(bing)毒(du)組(zu)成的嵌(qian)合(he)(he)體在(zai)(zai)(zai)(zai)猿猴(hou)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)中(zhong)復(fu)制能(neng)力下降,而轉染蚊蟲(chong)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)復(fu)制能(neng)力不(bu)受影響,用在(zai)(zai)(zai)(zai)蚊蟲(chong)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)傳代的嵌(qian)合(he)(he)病(bing)毒(du)在(zai)(zai)(zai)(zai)猿猴(hou)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)LLC—MK2中(zhong)不(bu)能(neng)夠(gou)形成噬斑,而在(zai)(zai)(zai)(zai)早(zao)期構建的DEN一(yi)(yi)4和(he)另一(yi)(yi)個(ge)TBEV病(bing)毒(du)株(zhu)構建的嵌(qian)合(he)(he)體在(zai)(zai)(zai)(zai)猿猴(hou)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)中(zhong)卻(que)能(neng)夠(gou)得到比DEN一(yi)(yi)4病(bing)毒(du)滴度高(gao)1000倍的嵌(qian)合(he)(he)病(bing)毒(du)。
神(shen)經(jing)(jing)內(nei)毒(du)性(xing)和神(shen)經(jing)(jing)外(wai)毒(du)性(xing) 神(shen)經(jing)(jing)內(nei)(外(wai))毒(du)性(xing)低(di)而免(mian)疫(yi)原性(xing)好是一(yi)個(ge)理想(xiang)疫(yi)苗(miao)應具(ju)備(bei)的(de)(de)品質,許多實(shi)驗室經(jing)(jing)過多年研究雖然(ran)篩檢出一(yi)些減毒(du)株,但是兩者多不能達(da)到(dao)有(you)效的(de)(de)統(tong)一(yi)。嵌(qian)(qian)合(he)病(bing)(bing)毒(du)技(ji)術以“取長補短”的(de)(de)原則,將兩種病(bing)(bing)毒(du)的(de)(de)免(mian)疫(yi)原性(xing)和毒(du)性(xing)結合(he)起來(lai),以期研制理想(xiang)疫(yi)苗(miao),就目前(qian)得(de)到(dao)的(de)(de)一(yi)些嵌(qian)(qian)合(he)株來(lai)說,確實(shi)取得(de)了一(yi)些令人滿意的(de)(de)結果,如DEN一(yi)4和WNV的(de)(de)嵌(qian)(qian)合(he)病(bing)(bing)毒(du)與(yu)WNV相比高度減毒(du)四,腦(nao)內(nei)接種戒(jie)奶小(xiao)鼠(shu)(shu),神(shen)經(jing)(jing)內(nei)毒(du)性(xing)降低(di)至(zhi)1/28500;腹腔內(nei)接種小(xiao)鼠(shu)(shu),神(shen)經(jing)(jing)外(wai)毒(du)性(xing)下(xia)降至(zhi)1/10000,免(mian)疫(yi)原性(xing)好,能安全(quan)保護(hu)小(xiao)鼠(shu)(shu)接受野生株攻擊。另外(wai)如ChimeriVax—JE嵌(qian)(qian)合(he)病(bing)(bing)毒(du)毒(du)性(xing)也較母體(ti)株YFV和JEV呈大幅度下(xia)降,而單劑(ji)量又(you)具(ju)備(bei)很好的(de)(de)免(mian)疫(yi)保護(hu)力;還有(you)DEN—TBEV、YFV-DEN、YFV—WNV等(deng)嵌(qian)(qian)合(he)病(bing)(bing)毒(du)株的(de)(de)毒(du)性(xing)都(dou)(dou)有(you)所下(xia)降,這些嵌(qian)(qian)合(he)體(ti)都(dou)(dou)在(zai)進一(yi)步的(de)(de)研究中。
神經(jing)內毒(du)性和(he)神經(jing)外毒(du)性
基因(yin)(yin)穩定性(xing) 因(yin)(yin)為RNA病(bing)毒(du)(du)易(yi)以(yi)準種的(de)(de)(de)形式出現(xian)和(he)(he)易(yi)變(bian)異(yi)的(de)(de)(de)特性(xing),作為活(huo)疫苗來使用,一個重要(yao)的(de)(de)(de)條件是(shi)基因(yin)(yin)型(xing)要(yao)穩定,這一點是(shi)疫苗安全性(xing)的(de)(de)(de)重要(yao)表現(xian)。嵌(qian)合病(bing)毒(du)(du)的(de)(de)(de)穩定性(xing)主(zhu)要(yao)通(tong)過返祖實驗檢定,即在(zai)乳(ru)鼠腦內和(he)(he)細(xi)(xi)胞中進(jin)(jin)行培養,觀察有無明顯表型(xing)變(bian)化,必要(yao)時(shi)進(jin)(jin)行核苷(gan)酸(suan)鑒定,如(ru)ChimeriVax-JE嵌(qian)合病(bing)毒(du)(du)115.161在(zai)細(xi)(xi)胞內傳(chuan)(chuan)代(dai)l8次以(yi)及在(zai)乳(ru)鼠腦內傳(chuan)(chuan)代(dai)6次并沒有毒(du)(du)力(li)(li)的(de)(de)(de)回(hui)升,對減(jian)毒(du)(du)位點進(jin)(jin)行測序也沒有發生(sheng)核苷(gan)酸(suan)改變(bian)。而(er)(er)有的(de)(de)(de)嵌(qian)合病(bing)毒(du)(du)穩定性(xing)不夠好如(ru)DEN一2/DEN一4、DEN一2/DEN—l復制能力(li)(li)較弱(ruo),而(er)(er)經(jing)過幾次傳(chuan)(chuan)代(dai)后得到較高(gao)(gao)的(de)(de)(de)病(bing)毒(du)(du)滴度,是(shi)因(yin)(yin)為發生(sheng)了一些(xie)突(tu)變(bian)。在(zai)體外轉錄時(shi)產生(sheng)了轉錄體的(de)(de)(de)雜和(he)(he)體,在(zai)轉染后經(jing)過細(xi)(xi)胞復制,復制能力(li)(li)增(zeng)強(qiang)的(de)(de)(de)病(bing)毒(du)(du)逐漸占主(zhu)要(yao)優勢,在(zai)LLC—MK2細(xi)(xi)胞中病(bing)毒(du)(du)傳(chuan)(chuan)代(dai)可(ke)以(yi)保持較高(gao)(gao)的(de)(de)(de)遺傳(chuan)(chuan)穩定性(xing),所以(yi)在(zai)制備嵌(qian)合疫苗時(shi),應盡量減(jian)少(shao)病(bing)毒(du)(du)在(zai)哺乳(ru)動物細(xi)(xi)胞中傳(chuan)(chuan)代(dai)的(de)(de)(de)次數。
基因穩定性
在黃熱病(bing)毒嵌合病(bing)毒發展(zhan)的這十幾年中,人(ren)們嘗(chang)試構建(jian)了多種嵌合病(bing)毒,其中大部分(fen)是以(yi)制(zhi)備(bei)疫苗為目(mu)的,另外(wai)還用于病(bing)毒的分(fen)子生物學(xue)特性研究。
分子生物(wu)學特性研(yan)究 型(xing)內嵌(qian)合病(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)可以用于(yu)了(le)解病(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)復制能力,進(jin)一(yi)步了(le)解各基(ji)因的(de)功能。如構建同型(xing)不同株之(zhi)間(jian)(jian)DEN一(yi)216681/PDK一(yi)53、DEN25ol/04株之(zhi)間(jian)(jian)的(de)型(xing)內嵌(qian)合疫(yi)(yi)苗(miao),研(yan)究DEN一(yi)2型(xing)病(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)結構蛋白區對(dui)乳鼠神(shen)經毒(du)(du)(du)性的(de)影響(xiang)(xiang)。可以用于(yu)推測(ce)病(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)毒(du)(du)(du)力位點,由(you)2個(ge)(ge)JEV病(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)株cDNA克(ke)隆提(ti)供(gong)5端,3個(ge)(ge)病(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)株cDNA提(ti)供(gong)的(de)3端進(jin)行組(zu)合,感染細(xi)胞后重(zhong)新獲得6種(zhong)重(zhong)組(zu)JEV病(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)。根據噬菌斑大小篩(shai)選(xuan)到3個(ge)(ge)減毒(du)(du)(du)株,比較6種(zhong)重(zhong)組(zu)病(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)株和(he)野生株的(de)基(ji)因序列,發現(xian)僅(jin)僅(jin)是E138(Glu—Lys)一(yi)個(ge)(ge)氨基(ji)酸位點不同,說明這個(ge)(ge)位點和(he)毒(du)(du)(du)力之(zhi)間(jian)(jian)關(guan)系(xi)(xi)密(mi)切;另(ling)外(wai)發現(xian)該突變株雖然毒(du)(du)(du)性降低,但是腦內注射(she)接種(zhong)小鼠后仍能在(zai)(zai)腦內復制,但是病(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)滴度比較低,看來(lai)其減毒(du)(du)(du)機制不在(zai)(zai)于(yu)病(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)的(de)復制,而可能是影響(xiang)(xiang)復制的(de)早期機制,在(zai)(zai)細(xi)胞之(zhi)間(jian)(jian)傳(chuan)遞速(su)度比較慢(man),從而使免疫(yi)(yi)系(xi)(xi)統能及時清(qing)除病(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)。
分子生物學特(te)性研究
型間(jian)嵌(qian)(qian)(qian)合(he)病(bing)(bing)(bing)毒也(ye)(ye)可以用于分子生(sheng)(sheng)物(wu)學特性的(de)(de)研(yan)究(jiu),如黃熱(re)(re)病(bing)(bing)(bing)毒和(he)(he)日本腦炎病(bing)(bing)(bing)毒雖(sui)然(ran)同(tong)(tong)屬(shu)黃熱(re)(re)病(bing)(bing)(bing)毒屬(shu),但(dan)是(shi)有很(hen)多生(sheng)(sheng)物(wu)學特性都不盡相(xiang)(xiang)同(tong)(tong),如抗原性相(xiang)(xiang)差很(hen)遠、中間(jian)宿主不同(tong)(tong)、引(yin)起人體(ti)發病(bing)(bing)(bing)的(de)(de)癥狀也(ye)(ye)截然(ran)不同(tong)(tong);兩者雖(sui)然(ran)從同(tong)(tong)一(yi)(yi)病(bing)(bing)(bing)毒得來(lai),但(dan)是(shi)在進(jin)化(hua)的(de)(de)過程(cheng)中發生(sheng)(sheng)了很(hen)大的(de)(de)變化(hua),構(gou)建的(de)(de)嵌(qian)(qian)(qian)合(he)病(bing)(bing)(bing)毒YF/JE(S)其(qi)生(sheng)(sheng)物(wu)學特性也(ye)(ye)有所(suo)改變,如神(shen)經內毒性和(he)(he)神(shen)經外(wai)毒性都有所(suo)降(jiang)低,和(he)(he)其(qi)供體(ti)株SAl4一(yi)(yi)l4—2相(xiang)(xiang)似;而構(gou)建的(de)(de)另一(yi)(yi)個嵌(qian)(qian)(qian)合(he)株YF/JE(N)神(shen)經毒性卻(que)很(hen)高(gao),和(he)(he)供體(ti)株Nakayama特性一(yi)(yi)致;這說明確(que)實如原先(xian)預料(liao),和(he)(he)減毒有關的(de)(de)表(biao)位主要(yao)存在E蛋(dan)白中,而同(tong)(tong)時也(ye)(ye)發現,和(he)(he)原來(lai)的(de)(de)SA14-14-2相(xiang)(xiang)比(bi)較(jiao),嵌(qian)(qian)(qian)合(he)株在細胞中復制能(neng)力(li)升高(gao),病(bing)(bing)(bing)毒滴度(du)較(jiao)高(gao),免疫原性增加(jia),這又說明是(shi)YF一(yi)(yi)17DD病(bing)(bing)(bing)毒的(de)(de)非結構(gou)蛋(dan)白發揮(hui)作用。
候選疫苗 ChimeriVax-JE嵌合(he)病(bing)毒(du)
候選疫苗
日本腦炎是一(yi)種(zhong)(zhong)影響(xiang)中(zhong)樞(shu)神(shen)經系統的(de)(de)(de)(de)疾病(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)(bing),主要流行(xing)于亞洲,但是近年在澳洲、美洲也有(you)病(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)例發生,每年官方報道全(quan)球有(you)5萬病(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)例,其中(zhong)有(you)l萬例是致死性的(de)(de)(de)(de);雖然目前(qian)有(you)活疫(yi)苗、滅活疫(yi)苗的(de)(de)(de)(de)使用,但是這些(xie)(xie)疫(yi)苗具有(you)免(mian)疫(yi)原性不夠(gou)、價格偏高、制作工藝不被(bei)WHO認可等劣勢,所以(yi)還有(you)必要開發研制新疫(yi)苗。1999年Chambers等以(yi)SA14-14-2的(de)(de)(de)(de)prM和(he)E基因(yin)代(dai)替YF一(yi)17DD疫(yi)苗株的(de)(de)(de)(de)相(xiang)應基因(yin)構建了嵌合(he)病(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)ChimeriVax—JE15,16,,該病(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)能(neng)在WHO認可的(de)(de)(de)(de)細胞中(zhong)很好地被(bei)培養,恢復病(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)和(he)YF一(yi)17DD、SA14—14-2相(xiang)比較,以(yi)6log0pfu的(de)(de)(de)(de)嵌合(he)病(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)腦內(nei)接種(zhong)(zhong)3-4周齡小鼠無一(yi)例發病(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)(bing),而(er)接種(zhong)(zhong)YF-17DD的(de)(de)(de)(de)小鼠全(quan)部(bu)死亡(wang);另外用3.2log0pfu劑量的(de)(de)(de)(de)SA14-14-2接種(zhong)(zhong),能(neng)在85%一(yi)95%的(de)(de)(de)(de)接種(zhong)(zhong)者(zhe)中(zhong)產生中(zhong)和(he)抗體(ti),抗體(ti)平均滴度能(neng)夠(gou)達(da)(da)到PRNT~o<30,血清(qing)陽轉率(lv)小于80%;而(er)接種(zhong)(zhong)4~51og0pfu的(de)(de)(de)(de)嵌合(he)疫(yi)苗后,能(neng)夠(gou)達(da)(da)到100%的(de)(de)(de)(de)血清(qing)陽轉率(lv),接種(zhong)(zhong)后30dPRNT能(neng)夠(gou)達(da)(da)到129~327,這些(xie)(xie)結果表明(ming)構建的(de)(de)(de)(de)嵌合(he)病(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)神(shen)經內(nei)毒(du)(du)性呈大幅(fu)度降(jiang)低;用乳鼠以(yi)及猴子進行(xing)安全(quan)試(shi)驗檢測,進一(yi)步證實了該病(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)的(de)(de)(de)(de)弱神(shen)經毒(du)(du)性,內(nei)臟毒(du)(du)性也下降(jiang)。目前(qian)該疫(yi)苗已經通過一(yi)期臨床試(shi)驗,是很有(you)前(qian)途的(de)(de)(de)(de)疫(yi)苗候選株。
登革病(bing)毒多價疫苗
登(deng)革病毒(du)(du)(du)(du)是目前誘發(fa)疾(ji)病最多(duo)的(de)(de)黃熱(re)病毒(du)(du)(du)(du),在人口聚集的(de)(de)熱(re)帶(dai)及亞(ya)熱(re)帶(dai)時有(you)(you)爆發(fa),因(yin)為登(deng)革病毒(du)(du)(du)(du)4個(ge)血(xue)清型(xing)(xing)(xing)之(zhi)間可以產(chan)生(sheng)(sheng)交(jiao)叉保(bao)護力(li)(li),所以感染(ran)一(yi)(yi)(yi)種病毒(du)(du)(du)(du)后(hou),能(neng)夠(gou)對另(ling)(ling)外3種血(xue)清型(xing)(xing)(xing)病毒(du)(du)(du)(du)的(de)(de)抗(kang)體(ti)(ti)反應(ying)。在機體(ti)(ti)遭受另(ling)(ling)一(yi)(yi)(yi)種血(xue)清型(xing)(xing)(xing)病毒(du)(du)(du)(du)的(de)(de)感染(ran)后(hou),由于抗(kang)體(ti)(ti)依賴的(de)(de)復制(zhi)能(neng)力(li)(li)增(zeng)強作用可能(neng)誘發(fa)DHF/DSS的(de)(de)發(fa)生(sheng)(sheng),因(yin)此理想(xiang)的(de)(de)疫苗應(ying)該(gai)能(neng)夠(gou)產(chan)生(sheng)(sheng)針(zhen)對4個(ge)型(xing)(xing)(xing)病毒(du)(du)(du)(du)的(de)(de)中和(he)抗(kang)體(ti)(ti)和(he)T細胞免疫。目前主要有(you)(you)兩個(ge)實驗室分別以DEN一(yi)(yi)(yi)2PDK一(yi)(yi)(yi)53和(he)YF一(yi)(yi)(yi)17DD作為受體(ti)(ti)株構建了(le)包括DEN一(yi)(yi)(yi)1到DEN-4型(xing)(xing)(xing)的(de)(de)嵌(qian)合株,結果(guo)有(you)(you)很好的(de)(de)免疫原性(xing)、較高(gao)的(de)(de)復制(zhi)效率和(he)穩定性(xing),在動物實驗中證(zheng)明(ming)毒(du)(du)(du)(du)性(xing)減低,小(xiao)鼠效力(li)(li)實驗安全有(you)(you)效,有(you)(you)望成(cheng)為登(deng)革病毒(du)(du)(du)(du)疫苗的(de)(de)發(fa)展方向(xiang)。
另外(wai)還(huan)有YF/TBE、YF/WNV、DEN4/TBE的(de)報道,都出現一(yi)些(xie)令人(ren)滿意(yi)的(de)特性(xing),進一(yi)步(bu)研(yan)究正在(zai)進行中。嵌合病(bing)毒(du)(du)的(de)出現是獲得(de)減毒(du)(du)活疫苗的(de)一(yi)個新(xin)(xin)途徑,和(he)傳統方法相(xiang)比(bi)具有目標明確(que)、免疫效(xiao)果好、減毒(du)(du)穩定的(de)優勢,但該技術目前還(huan)處(chu)于(yu)探索階段,有時結果很(hen)出人(ren)意(yi)料(liao),所以(yi)在(zai)構建(jian)一(yi)個新(xin)(xin)的(de)嵌合體時,要時刻(ke)注意(yi)安全性(xing)問(wen)題,否則(ze)會適得(de)其反,創造出新(xin)(xin)的(de)毒(du)(du)性(xing)更強的(de)病(bing)毒(du)(du),為人(ren)類帶來危害(hai)。
嵌(qian)合疫(yi)(yi)苗(miao)(miao)是(shi)應(ying)用(yong)基(ji)因工程手(shou)段構建(jian)基(ji)因能表達兩種以上病(bing)原(yuan)體(ti)抗原(yuan)的(de)一(yi)(yi)類新型疫(yi)(yi)苗(miao)(miao),應(ying)用(yong)嵌(qian)合疫(yi)(yi)苗(miao)(miao)可(ke)解決多次接種問(wen)題。本文綜述了目前世界一(yi)(yi)些國家(jia)研制的(de)嵌(qian)合疫(yi)(yi)苗(miao)(miao),如登革病(bing)毒(du)、乙型腦炎病(bing)毒(du)、呼吸道(dao)合胞病(bing)毒(du)、副流感(gan)病(bing)毒(du)、人類免疫(yi)(yi)缺陷病(bing)病(bing)毒(du)及人乳頭瘤病(bing)毒(du)等相關嵌(qian)合疫(yi)(yi)苗(miao)(miao)的(de)研究策(ce)略和方法(fa)、免疫(yi)(yi)學評(ping)價及其應(ying)用(yong)前景(jing)。