黃熱(re)(re)病(bing)毒屬(shu)(1qav/virus)包含80多(duo)個成員，屬(shu)于正鏈(lian)RNA病(bing)毒，其中(zhong)半數(shu)以(yi)上的(de)病(bing)毒能夠誘發人(ren)(ren)和動物(wu)產生疾病(bing)，患病(bing)率高而治愈率低，容(rong)易留下一些(xie)嚴重(zhong)的(de)后遺癥，給人(ren)(ren)類健康帶來很(hen)大威脅，如流行性乙型(xing)腦炎病(bing)毒(JEV)、登(deng)革熱(re)(re)病(bing)病(bing)毒(DEN)、黃熱(re)(re)病(bing)毒(YFV)、蜱傳腦炎病(bing)毒(TBEV)等。一直(zhi)以(yi)來人(ren)(ren)們對RNA病(bing)毒的(de)了解(jie)都(dou)比較缺乏，無論是分(fen)子水平上的(de)機理(li)研究，還是宏觀上疫苗的(de)研制、藥物(wu)的(de)開(kai)發，其進展都(dou)非常緩慢。
嵌(qian)合(he)病(bing)(bing)(bing)毒(du)是(shi)(shi)一種基因(yin)工程重(zhong)組(zu)病(bing)(bing)(bing)毒(du)，在(zai)制備(bei)技術上并不(bu)存在(zai)太(tai)大問題，但作(zuo)為重(zhong)組(zu)病(bing)(bing)(bing)毒(du)，在(zai)安全性(xing)(xing)上還有一定(ding)的風險，在(zai)自(zi)然條件下(xia)(xia)，有病(bing)(bing)(bing)毒(du)之間自(zi)發產生(sheng)重(zhong)組(zu)的例子，可(ke)能獲(huo)得一些意(yi)想不(bu)到的新型病(bing)(bing)(bing)毒(du)，比母體(ti)株(zhu)(zhu)毒(du)力更強，對生(sheng)物體(ti)更具有威脅性(xing)(xing)。所(suo)以在(zai)制備(bei)嵌(qian)合(he)病(bing)(bing)(bing)毒(du)時(shi)，要采(cai)用已知特(te)性(xing)(xing)的病(bing)(bing)(bing)毒(du)株(zhu)(zhu)作(zuo)為嵌(qian)合(he)病(bing)(bing)(bing)毒(du)的骨架結構，特(te)別(bie)是(shi)(shi)多選用減毒(du)株(zhu)(zhu)作(zuo)為載體(ti)病(bing)(bing)(bing)毒(du)目前黃熱(re)病(bing)(bing)(bing)毒(du)的嵌(qian)合(he)病(bing)(bing)(bing)毒(du)采(cai)用的載體(ti)主要有以下(xia)(xia)幾種。
YF一(yi)17DD 疫(yi)(yi)(yi)(yi)苗(miao)(miao)(miao)株(zhu)(zhu)(zhu) YF一(yi)17DD是(shi)目前預防黃熱病(bing)(bing)毒(du)感染(ran)的(de)(de)(de)一(yi)株(zhu)(zhu)(zhu)減毒(du)活(huo)疫(yi)(yi)(yi)(yi)苗(miao)(miao)(miao)】，始(shi)用于(yu)1936年(nian)，在(zai)(zai)過去的(de)(de)(de)6O多(duo)年(nian)中(zhong)(zhong)(zhong)，有(you)超(chao)過3億人(ren)接(jie)(jie)種(zhong)(zhong)過該疫(yi)(yi)(yi)(yi)苗(miao)(miao)(miao)，安(an)全有(you)效。該疫(yi)(yi)(yi)(yi)苗(miao)(miao)(miao)株(zhu)(zhu)(zhu)免疫(yi)(yi)(yi)(yi)原(yuan)性(xing)很好，單劑量(liang)接(jie)(jie)種(zhong)(zhong)后(hou)10d內，近lo0%的(de)(de)(de)接(jie)(jie)種(zhong)(zhong)者產(chan)生中(zhong)(zhong)(zhong)和(he)(he)抗(kang)體，免疫(yi)(yi)(yi)(yi)力持久甚至能夠維持終身(shen)。將YF一(yi)17DD疫(yi)(yi)(yi)(yi)苗(miao)(miao)(miao)株(zhu)(zhu)(zhu)和(he)(he)原(yuan)病(bing)(bing)毒(du)株(zhu)(zhu)(zhu)YF—Asibi進(jin)行序列比較(jiao)后(hou)發現，該病(bing)(bing)毒(du)的(de)(de)(de)抗(kang)原(yuan)表位多(duo)集中(zhong)(zhong)(zhong)在(zai)(zai)E基因(yin)，構(gou)建(jian)(jian)嵌(qian)合(he)病(bing)(bing)毒(du)多(duo)以這(zhe)一(yi)段基因(yin)作(zuo)(zuo)為(wei)靶(ba)基因(yin)。這(zhe)樣構(gou)建(jian)(jian)的(de)(de)(de)嵌(qian)合(he)病(bing)(bing)毒(du)中(zhong)(zhong)(zhong)，由(you)YF一(yi)17DD株(zhu)(zhu)(zhu)保留(liu)的(de)(de)(de)NS蛋白基因(yin)只是(shi)誘發針(zhen)對該蛋白的(de)(de)(de)CTLs和(he)(he)非中(zhong)(zhong)(zhong)和(he)(he)性(xing)抗(kang)體，而不具有(you)交(jiao)叉保護性(xing)，所以嵌(qian)合(he)病(bing)(bing)毒(du)作(zuo)(zuo)為(wei)疫(yi)(yi)(yi)(yi)苗(miao)(miao)(miao)使用時不會引起一(yi)般重組病(bing)(bing)毒(du)帶來的(de)(de)(de)抗(kang)載體免疫(yi)(yi)(yi)(yi)反應，即(ji)使曾經接(jie)(jie)種(zhong)(zhong)過YF一(yi)17DD的(de)(de)(de)接(jie)(jie)痘(dou)者再(zai)接(jie)(jie)種(zhong)(zhong)嵌(qian)合(he)病(bing)(bing)毒(du)也是(shi)安(an)全有(you)效的(de)(de)(de)，可以作(zuo)(zuo)為(wei)一(yi)個(ge)理想的(de)(de)(de)活(huo)疫(yi)(yi)(yi)(yi)苗(miao)(miao)(miao)株(zhu)(zhu)(zhu)嵌(qian)合(he)病(bing)(bing)毒(du)載體。1989年(nian)Rice等151構(gou)建(jian)(jian)了YF一(yi)17DD的(de)(de)(de)感染(ran)性(xing)克隆，為(wei)構(gou)建(jian)(jian)嵌(qian)合(he)病(bing)(bing)毒(du)提供了方便，目前文獻中(zhong)(zhong)(zhong)報道的(de)(de)(de)有(you)關黃熱病(bing)(bing)毒(du)嵌(qian)合(he)株(zhu)(zhu)(zhu)多(duo)以此病(bing)(bing)毒(du)株(zhu)(zhu)(zhu)作(zuo)(zuo)為(wei)載體病(bing)(bing)毒(du)。已經成功構(gou)建(jian)(jian)了包(bao)括JEV、TBE、WNV、DEN等4個(ge)血清型病(bing)(bing)毒(du)的(de)(de)(de)嵌(qian)合(he)體。
YF一(yi)17DD 疫苗株(zhu)
DEN一(yi)(yi)(yi)4變異株(zhu) 登(deng)革病(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)分為(wei)4個(ge)(ge)血清(qing)型，這4型病(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)結構蛋(dan)白氨基酸序(xu)列同源性高達62%-74%，并且它(ta)(ta)們之間(jian)還(huan)有(you)很好(hao)的(de)(de)(de)(de)(de)交叉免(mian)疫原性，一(yi)(yi)(yi)直以來，人們試圖構建(jian)登(deng)革病(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)的(de)(de)(de)(de)(de)4價疫苗，Bray等從1991年開始登(deng)革病(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)嵌(qian)(qian)合(he)(he)(he)病(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)的(de)(de)(de)(de)(de)研(yan)究，以DEN一(yi)(yi)(yi)4814669株(zhu)全(quan)長克隆(long)作(zuo)為(wei)載(zai)體(ti)(ti)，構建(jian)了(le)包括DEN—l到(dao)DEN一(yi)(yi)(yi)3的(de)(de)(de)(de)(de)嵌(qian)(qian)合(he)(he)(he)病(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)，結果(guo)發現(xian)幾株(zhu)病(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)的(de)(de)(de)(de)(de)毒(du)(du)(du)性并沒(mei)(mei)有(you)太(tai)大改(gai)變，他(ta)們認(ren)為(wei)若能(neng)夠以一(yi)(yi)(yi)個(ge)(ge)毒(du)(du)(du)性低(di)(di)的(de)(de)(de)(de)(de)DEN-4病(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)作(zuo)為(wei)載(zai)體(ti)(ti)骨架，可能(neng)會使嵌(qian)(qian)合(he)(he)(he)病(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)毒(du)(du)(du)性下降，由于(yu)3端(duan)(duan)和(he)5端(duan)(duan)非(fei)編碼區在病(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)的(de)(de)(de)(de)(de)復(fu)制中(zhong)可能(neng)也起到(dao)調控作(zuo)用(yong)(yong)，他(ta)們在構建(jian)的(de)(de)(de)(de)(de)DEN一(yi)(yi)(yi)4感染性克隆(long)的(de)(de)(de)(de)(de)基礎上，刪除(chu)其(qi)3端(duan)(duan)和(he)5端(duan)(duan)非(fei)編碼區的(de)(de)(de)(de)(de)部分序(xu)列，結果(guo)篩(shai)選到(dao)一(yi)(yi)(yi)株(zhu)減毒(du)(du)(du)株(zhu)，其(qi)3端(duan)(duan)去掉了(le)3O個(ge)(ge)核苷(gan)酸，毒(du)(du)(du)性降低(di)(di)但是(shi)免(mian)疫原性并沒(mei)(mei)有(you)改(gai)變。用(yong)(yong)這個(ge)(ge)減毒(du)(du)(du)株(zhu)作(zuo)為(wei)載(zai)體(ti)(ti)和(he)其(qi)它(ta)(ta)3個(ge)(ge)血清(qing)型的(de)(de)(de)(de)(de)登(deng)革病(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)構成(cheng)(cheng)嵌(qian)(qian)合(he)(he)(he)病(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)后(hou)，果(guo)然有(you)效地(di)降低(di)(di)了(le)病(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)毒(du)(du)(du)性；其(qi)后(hou)這個(ge)(ge)載(zai)體(ti)(ti)也用(yong)(yong)于(yu)構建(jian)黃熱病(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)屬其(qi)他(ta)成(cheng)(cheng)員(yuan)的(de)(de)(de)(de)(de)嵌(qian)(qian)合(he)(he)(he)病(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)。
DEN一4變(bian)異株
DEN一(yi)(yi)2 PDK一(yi)(yi)53減(jian)毒(du)(du)株(zhu) 該(gai)減(jian)毒(du)(du)株(zhu)也(ye)主(zhu)(zhu)要(yao)是用(yong)于(yu)合(he)成登(deng)革(ge)病(bing)(bing)毒(du)(du)的(de)(de)嵌合(he)疫(yi)苗(miao)，2O世紀8O年(nian)代初期(qi)，泰國Mahidol實(shi)驗室將4種血清(qing)型的(de)(de)登(deng)革(ge)病(bing)(bing)毒(du)(du)經過在細胞傳(chuan)代中(zhong)后獲得(de)各自的(de)(de)減(jian)毒(du)(du)株(zhu)，其(qi)中(zhong)以DEN一(yi)(yi)2PDK一(yi)(yi)53減(jian)毒(du)(du)株(zhu)減(jian)毒(du)(du)效果最(zui)好，免疫(yi)保(bao)護力(li)(li)最(zui)強(qiang)最(zui)持久(jiu)。將該(gai)減(jian)毒(du)(du)株(zhu)和(he)野生株(zhu)進行比較，發(fa)現核苷酸水平上的(de)(de)變異主(zhu)(zhu)要(yao)在非(fei)結構(gou)(gou)區(qu)，說明該(gai)病(bing)(bing)毒(du)(du)株(zhu)和(he)毒(du)(du)力(li)(li)有(you)關的(de)(de)基(ji)因(yin)可能在非(fei)結構(gou)(gou)區(qu)，而(er)黃(huang)熱病(bing)(bing)毒(du)(du)屬(shu)其(qi)他成員(yuan)的(de)(de)毒(du)(du)力(li)(li)基(ji)因(yin)多位于(yu)E蛋白，這樣構(gou)(gou)建的(de)(de)嵌合(he)病(bing)(bing)毒(du)(du)減(jian)毒(du)(du)機制主(zhu)(zhu)要(yao)由(you)(you)供體株(zhu)的(de)(de)毒(du)(du)性(xing)起主(zhu)(zhu)要(yao)因(yin)素，而(er)由(you)(you)DEN一(yi)(yi)2PDK-53減(jian)毒(du)(du)株(zhu)構(gou)(gou)建的(de)(de)嵌合(he)疫(yi)苗(miao)毒(du)(du)性(xing)的(de)(de)減(jian)弱由(you)(you)供體和(he)受體共同決定(ding)，更(geng)有(you)利于(yu)減(jian)毒(du)(du)株(zhu)的(de)(de)獲得(de)
DEN一2 PDK一53減毒株
DEN一(yi)(yi)(yi)2減(jian)(jian)毒(du)株作為嵌(qian)合(he)病(bing)毒(du)的(de)(de)(de)(de)載(zai)體(ti)還有(you)另(ling)外一(yi)(yi)(yi)個好處，登革病(bing)毒(du)4個血(xue)(xue)清(qing)(qing)型(xing)(xing)(xing)之(zhi)間產生(sheng)交叉免(mian)(mian)疫(yi)(yi)力，所以異型(xing)(xing)(xing)病(bing)毒(du)的(de)(de)(de)(de)二次感染(ran)由(you)于(yu)抗體(ti)依賴(lai)的(de)(de)(de)(de)增強作用可以導(dao)致登革出(chu)血(xue)(xue)熱/登革熱休克綜合(he)征(DHF/DSS)的(de)(de)(de)(de)發(fa)生(sheng)，理想的(de)(de)(de)(de)登革4價(jia)(jia)疫(yi)(yi)苗誘(you)(you)(you)導(dao)的(de)(de)(de)(de)免(mian)(mian)疫(yi)(yi)力要(yao)針(zhen)(zhen)對4種(zhong)血(xue)(xue)清(qing)(qing)型(xing)(xing)(xing)病(bing)毒(du)，有(you)效(xiao)而且要(yao)持(chi)久，其(qi)(qi)(qi)中(zhong)任何一(yi)(yi)(yi)種(zhong)血(xue)(xue)清(qing)(qing)型(xing)(xing)(xing)抗體(ti)的(de)(de)(de)(de)消減(jian)(jian)都有(you)發(fa)生(sheng)DHF/DSS的(de)(de)(de)(de)可能。流行病(bing)學資料表明，DEN幾個血(xue)(xue)清(qing)(qing)型(xing)(xing)(xing)感染(ran)人(ren)的(de)(de)(de)(de)概(gai)(gai)率(lv)是不(bu)同的(de)(de)(de)(de)，其(qi)(qi)(qi)中(zhong)以DEN一(yi)(yi)(yi)2的(de)(de)(de)(de)感染(ran)概(gai)(gai)率(lv)最高，所以由(you)其(qi)(qi)(qi)它幾種(zhong)血(xue)(xue)清(qing)(qing)型(xing)(xing)(xing)病(bing)毒(du)誘(you)(you)(you)發(fa)的(de)(de)(de)(de)免(mian)(mian)疫(yi)(yi)反應很易識別DEN一(yi)(yi)(yi)2病(bing)毒(du)，由(you)此DEN一(yi)(yi)(yi)2病(bing)毒(du)誘(you)(you)(you)發(fa)DHF/DSS的(de)(de)(de)(de)概(gai)(gai)率(lv)明顯(xian)大于(yu)DEN—l、一(yi)(yi)(yi)3、一(yi)(yi)(yi)4；另(ling)外DEN一(yi)(yi)(yi)2病(bing)毒(du)誘(you)(you)(you)導(dao)的(de)(de)(de)(de)特異免(mian)(mian)疫(yi)(yi)力又明顯(xian)弱(ruo)于(yu)其(qi)(qi)(qi)它3型(xing)(xing)(xing)，所以制備以DEN一(yi)(yi)(yi)2為基礎的(de)(de)(de)(de)4價(jia)(jia)疫(yi)(yi)苗和傳統疫(yi)(yi)苗比較，減(jian)(jian)少了(le)DEN—l、一(yi)(yi)(yi)3、一(yi)(yi)(yi)4的(de)(de)(de)(de)4種(zhong)血(xue)(xue)清(qing)(qing)型(xing)(xing)(xing)NS3蛋(dan)白誘(you)(you)(you)發(fa)的(de)(de)(de)(de)交叉免(mian)(mian)疫(yi)(yi)反應之(zhi)間的(de)(de)(de)(de)干擾(rao)作用，減(jian)(jian)少了(le)DHF/DSS的(de)(de)(de)(de)可能，同時又能有(you)效(xiao)而持(chi)久地誘(you)(you)(you)導(dao)機體(ti)產生(sheng)針(zhen)(zhen)對4種(zhong)血(xue)(xue)清(qing)(qing)型(xing)(xing)(xing)的(de)(de)(de)(de)免(mian)(mian)疫(yi)(yi)反應，從(cong)而起到預防作用。
克(ke)(ke)隆(long)(long)法 嵌合(he)(he)病(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)的獲得大(da)多是(shi)(shi)利(li)用(yong)感(gan)染性克(ke)(ke)隆(long)(long)技術(shu)(shu)，目前已有部(bu)(bu)分黃熱(re)病(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)屬(shu)病(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)獲得了(le)感(gan)染性克(ke)(ke)隆(long)(long)，如YFV、TBEV、Kunjin病(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)、墨累河(he)谷(gu)腦炎病(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(MVE)、西尼羅河(he)病(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(WNV)、DEN4型(xing)病(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)，這(zhe)些克(ke)(ke)隆(long)(long)包含有病(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)的全(quan)部(bu)(bu)基(ji)因，能夠在(zai)(zai)宿(su)主菌中穩定地(di)復(fu)制和傳(chuan)代，以作(zuo)為種子批保存(cun)。當(dang)構(gou)建嵌合(he)(he)體(ti)(ti)時，在(zai)(zai)供體(ti)(ti)基(ji)因和受(shou)體(ti)(ti)基(ji)因的連接處，通過同義突(tu)變(bian)或者保守(shou)突(tu)變(bian)，為受(shou)體(ti)(ti)株和供體(ti)(ti)株基(ji)因組(zu)添加合(he)(he)適的酶切(qie)位點，然后將兩者利(li)用(yong)酶切(qie)位點連接起來，制備嵌合(he)(he)性克(ke)(ke)隆(long)(long)，體(ti)(ti)外經RNA聚合(he)(he)酶作(zuo)用(yong)轉(zhuan)錄(lu)出嵌合(he)(he)性轉(zhuan)錄(lu)子，轉(zhuan)染細胞后重新獲得嵌合(he)(he)病(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)。這(zhe)項技術(shu)(shu)的一個優(you)點在(zai)(zai)于在(zai)(zai)它是(shi)(shi)在(zai)(zai)cDNA水(shui)平上的操作(zuo)，突(tu)變(bian)率低、表型(xing)穩定，不像傳(chuan)統疫苗研制過程中容易發生(sheng)一系列的生(sheng)物(wu)特(te)性改變(bian)。
克隆法
融合(he)PCR 利(li)用(yong)PCR技(ji)術制備嵌合(he)病毒(du)最大(da)的(de)優(you)點在于方便(bian)快捷，過去幾個(ge)月的(de)工(gong)作現(xian)在幾天(tian)就能完成。目(mu)前生(sheng)物技(ji)術產(chan)品日臻完善，不少公(gong)司推出(chu)高(gao)保真、熱穩定(ding)性好的(de)逆(ni)轉(zhuan)錄(lu)酶(mei)和DNA聚(ju)合(he)酶(mei)，如(ru)SuperscriptII逆(ni)轉(zhuan)錄(lu)酶(mei)、LAro~酶(mei)、Exraq酶(mei)、ExpandlongtemplatePCR聚(ju)合(he)酶(mei)系統等，利(li)用(yong)這些酶(mei)可以有效地擴(kuo)增(zeng)出(chu)病毒(du)基(ji)因組大(da)片段(>5kh)甚至全長(chang)的(de)cDNA。用(yong)4條(tiao)引物、3次PCR可以把兩(liang)個(ge)異質基(ji)因片段連接(jie)在一起。另有報道利(li)用(yong)3個(ge)引物、兩(liang)次PCR即可制備嵌合(he)基(ji)因，如(ru)YF—MOD嵌合(he)病毒(du)。
融合PCR
與克隆(long)技術相比較，PCR方法更為靈活，可以選擇任意位置(zhi)進行嵌合；但是(shi)PCR具有一(yi)(yi)定的突(tu)(tu)變率，可能會帶來一(yi)(yi)些致死性突(tu)(tu)變而(er)使轉錄體不(bu)具有感染性，得不(bu)到(dao)恢復病毒從而(er)前功盡棄，所(suo)以現在大(da)多數實驗還是(shi)采取克隆(long)法。
滅(mie)(mie)活病(bing)(bing)毒(du)之間的(de)基因(yin)重(zhong)組 是將(jiang)兩(liang)種(zhong)或者兩(liang)種(zhong)以(yi)上的(de)滅(mie)(mie)活病(bing)(bing)毒(du)，在同(tong)一細胞內(nei)培(pei)養后，它們(men)之間發生基因(yin)重(zhong)組，有時會產生感(gan)染性病(bing)(bing)毒(du)，這種(zhong)方法(fa)又稱為(wei)多重(zhong)復(fu)合(he)(he)，可(ke)能由于(yu)滅(mie)(mie)活病(bing)(bing)毒(du)受損的(de)基因(yin)經重(zhong)組后得以(yi)替補(bu)。如為(wei)了解包膜病(bing)(bing)毒(du)的(de)融(rong)(rong)(rong)合(he)(he)活性，利用黃(huang)熱病(bing)(bing)毒(du)YF一17DD和流(liu)感(gan)病(bing)(bing)毒(du)X31兩(liang)者不同(tong)的(de)融(rong)(rong)(rong)合(he)(he)條件，以(yi)及核衣殼不同(tong)的(de)形態(tai)，將(jiang)YF一17DD通過酸處理失去融(rong)(rong)(rong)合(he)(he)活性，X31通過熱處理滅(mie)(mie)活，兩(liang)者在YF一17DD滅(mie)(mie)活的(de)同(tong)一pH值下發生融(rong)(rong)(rong)和反(fan)應，只有發生融(rong)(rong)(rong)和反(fan)應的(de)嵌合(he)(he)病(bing)(bing)毒(du)具有感(gan)染性；流(liu)感(gan)病(bing)(bing)毒(du)提(ti)供功能型膜蛋白融(rong)(rong)(rong)合(he)(he)成分，YF一17DD提(ti)供功能基因(yin)組，結(jie)果兩(liang)個滅(mie)(mie)活病(bing)(bing)毒(du)又重(zhong)新構建成新的(de)病(bing)(bing)毒(du)。這項(xiang)技術(shu)隨機(ji)性很(hen)大(da)，但是可(ke)能得到意想不到的(de)結(jie)果，可(ke)以(yi)用于(yu)病(bing)(bing)毒(du)功能的(de)研(yan)究。
黃熱病毒(du)(du)嵌(qian)(qian)合病毒(du)(du)的(de)(de)構(gou)建(jian)前提在于，所有的(de)(de)黃熱病毒(du)(du)的(de)(de)病毒(du)(du)基(ji)因(yin)組(zu)的(de)(de)結構(gou)是高(gao)度保守(shou)的(de)(de)，它(ta)們均(jun)為單股正鏈RNA病毒(du)(du)，基(ji)因(yin)組(zu)全長約l1kb，5端(duan)有帽子結構(gou)，3端(duan)無poly(A)尾(wei)，一(yi)個(ge)長的(de)(de)開(kai)放閱讀框架覆蓋(gai)了大部分(fen)基(ji)因(yin)組(zu)，共編碼3個(ge)結構(gou)蛋白和7個(ge)非結構(gou)蛋白，其中以E蛋白和免疫原(yuan)性關系最(zui)為密(mi)切，所以構(gou)建(jian)的(de)(de)嵌(qian)(qian)合病毒(du)(du)一(yi)般都要取供體病毒(du)(du)的(de)(de)E基(ji)因(yin)；但(dan)并不是所有構(gou)建(jian)的(de)(de)嵌(qian)(qian)合性cDNA克(ke)隆都具有感染性，其主(zhu)要影響(xiang)因(yin)素(su)如下。
技術方面 雖然現在(zai)工具酶的(de)保真性(xing)和效率越來越好，但是(shi)黃熱(re)病(bing)毒長10kb以上，在(zai)基因操作中不可避(bi)免(mian)有(you)(you)突變的(de)發(fa)(fa)生，而有(you)(you)些突變是(shi)致(zhi)死性(xing)突變，使得構建的(de)全長cDNA克隆或(huo)者嵌合體(ti)克隆沒有(you)(you)感(gan)染性(xing)。另(ling)外這些突變還影響恢復病(bing)毒的(de)生物學特性(xing)，如溫度敏感(gan)性(xing)、噬斑大小、復制能(neng)力(li)、嗜細胞能(neng)力(li)都可能(neng)發(fa)(fa)生改變。
技術方面
嵌合位(wei)點(dian)(dian)(dian) 結構(gou)(gou)(gou)蛋白(bai)(bai)基(ji)因(yin)之間的(de)(de)連接(jie)處有一(yi)段(duan)親脂區序列(lie)，是構(gou)(gou)(gou)建(jian)嵌合病(bing)(bing)毒(du)時將兩段(duan)異質(zhi)核(he)苷酸(suan)序列(lie)進(jin)(jin)行(xing)連接(jie)的(de)(de)嵌合位(wei)點(dian)(dian)(dian)處，這(zhe)一(yi)段(duan)序列(lie)的(de)(de)保守性對于嵌合病(bing)(bing)毒(du)的(de)(de)復制(zhi)能力至關重要。如(ru)在(zai)(zai)prM和C基(ji)因(yin)之間有信(xin)號肽酶(mei)切(qie)(qie)割(ge)(ge)位(wei)點(dian)(dian)(dian)以及蛋白(bai)(bai)酶(mei)切(qie)(qie)割(ge)(ge)位(wei)點(dian)(dian)(dian)，Cau—four等在(zai)(zai)構(gou)(gou)(gou)建(jian)YF17D—DEN2嵌合病(bing)(bing)毒(du)時選擇這(zhe)兩處作為(wei)嵌合位(wei)點(dian)(dian)(dian)，結果在(zai)(zai)信(xin)號肽酶(mei)切(qie)(qie)割(ge)(ge)位(wei)點(dian)(dian)(dian)處嵌合的(de)(de)病(bing)(bing)毒(du)有感染性，而(er)在(zai)(zai)蛋白(bai)(bai)酶(mei)切(qie)(qie)割(ge)(ge)位(wei)點(dian)(dian)(dian)處進(jin)(jin)行(xing)連接(jie)無(wu)法(fa)獲得(de)病(bing)(bing)毒(du)，因(yin)為(wei)在(zai)(zai)兩個位(wei)點(dian)(dian)(dian)之間有一(yi)段(duan)親脂性的(de)(de)轉膜(mo)區，YFv這(zhe)一(yi)區域比DEN一(yi)2該區域要多6個氨基(ji)酸(suan)；在(zai)(zai)蛋白(bai)(bai)酶(mei)切(qie)(qie)割(ge)(ge)位(wei)點(dian)(dian)(dian)處構(gou)(gou)(gou)建(jian)的(de)(de)嵌合體，由于這(zhe)一(yi)轉膜(mo)區缺少了(le)6個氨基(ji)酸(suan)，蛋白(bai)(bai)酶(mei)和信(xin)號肽酶(mei)不能正確(que)識(shi)別切(qie)(qie)割(ge)(ge)位(wei)點(dian)(dian)(dian)，從而(er)影響prM蛋白(bai)(bai)和E蛋白(bai)(bai)的(de)(de)成熟，病(bing)(bing)毒(du)的(de)(de)復制(zhi)過程受到阻礙，病(bing)(bing)毒(du)顆粒沒法(fa)進(jin)(jin)行(xing)正常的(de)(de)包裝，所以無(wu)法(fa)分(fen)泌出病(bing)(bing)毒(du)顆粒。
嵌合位點
供體(ti)病毒(du)(du)(du)(du)基(ji)(ji)因(yin) 目前構建(jian)的(de)(de)嵌(qian)合(he)病毒(du)(du)(du)(du)多為供體(ti)株提(ti)供P和E基(ji)(ji)因(yin)，人們也嘗試過替(ti)代C基(ji)(ji)因(yin)或(huo)者部分基(ji)(ji)因(yin)，但多數沒有(you)成功，其(qi)可能(neng)的(de)(de)原因(yin)是位(wei)于C蛋(dan)白(bai)區(qu)域的(de)(de)保守序列(lie)與受(shou)體(ti)株病毒(du)(du)(du)(du)順式結構不相(xiang)容(rong)性，進(jin)而(er)對嵌(qian)合(he)病毒(du)(du)(du)(du)RNA的(de)(de)復(fu)制(zhi)(zhi)(zhi)產生了毒(du)(du)(du)(du)性，如Kuniin病毒(du)(du)(du)(du)RNA復(fu)制(zhi)(zhi)(zhi)必須(xu)有(you)同(tong)源C蛋(dan)白(bai)上的(de)(de)第(di)2位(wei)和第(di)20位(wei)氨基(ji)(ji)酸的(de)(de)存，而(er)異質基(ji)(ji)因(yin)的(de)(de)C蛋(dan)白(bai)不能(neng)協助Kunjin病毒(du)(du)(du)(du)復(fu)制(zhi)(zhi)(zhi)，所以無法長成病毒(du)(du)(du)(du)顆粒(li)；另外也可能(neng)是異質病毒(du)(du)(du)(du)之間的(de)(de)蛋(dan)白(bai)酶識別(bie)對方(fang)序列(lie)的(de)(de)能(neng)力(li)(li)低下，對于C—prM部位(wei)的(de)(de)切割效(xiao)率(lv)低，影響病毒(du)(du)(du)(du)正常的(de)(de)裝配(pei)和釋(shi)放能(neng)力(li)(li)。
供體病毒
受(shou)體(ti)病(bing)毒基(ji)(ji)因 作(zuo)為嵌(qian)(qian)合(he)(he)病(bing)毒載體(ti)，嵌(qian)(qian)合(he)(he)病(bing)毒中的(de)(de)(de)大(da)部分(fen)基(ji)(ji)因由受(shou)體(ti)株提(ti)供，嵌(qian)(qian)合(he)(he)病(bing)毒的(de)(de)(de)復制特(te)性(xing)也主(zhu)要由受(shou)體(ti)株的(de)(de)(de)基(ji)(ji)因控制，其中有(you)些(xie)序(xu)列(lie)對(dui)于嵌(qian)(qian)合(he)(he)體(ti)的(de)(de)(de)感(gan)(gan)染(ran)性(xing)有(you)決定性(xing)作(zuo)用，在構建(jian)嵌(qian)(qian)合(he)(he)體(ti)時，如果這部分(fen)序(xu)列(lie)受(shou)到破壞，就(jiu)不(bu)能夠獲得恢復病(bing)毒。如在構建(jian)DEN一(yi)4和WNV的(de)(de)(de)嵌(qian)(qian)合(he)(he)病(bing)毒時四，由WNVNY99的(de)(de)(de)prM和E基(ji)(ji)因代替(ti)DEN一(yi)4相應(ying)位(wei)置的(de)(de)(de)基(ji)(ji)因，在構建(jian)的(de)(de)(de)18個克(ke)隆中僅(jin)有(you)兩(liang)個具有(you)感(gan)(gan)染(ran)性(xing)，序(xu)列(lie)比較發現(xian)這兩(liang)個克(ke)隆在prM和C蛋白(bai)之(zhi)間(jian)的(de)(de)(de)NS2A—NS2B蛋白(bai)酶切(qie)割位(wei)點(dian)下游(you)，在轉膜(mo)信號區(qu)域(yu)中都(dou)包含一(yi)基(ji)(ji)序(xu)，這一(yi)基(ji)(ji)序(xu)是酶切(qie)割位(wei)點(dian)下游(you)的(de)(de)(de)第(di)3位(wei)及第(di)6位(wei)分(fen)別(bie)為天(tian)冬(dong)氨(an)酸(suan)和蘇氨(an)酸(suan)，另外16個克(ke)隆則沒有(you)該位(wei)點(dian)，實驗表明這兩(liang)個位(wei)點(dian)似乎(hu)和嵌(qian)(qian)合(he)(he)性(xing)克(ke)隆的(de)(de)(de)感(gan)(gan)染(ran)性(xing)有(you)關。
受體病毒
嵌合病毒的(de)(de)一(yi)個(ge)最大特(te)點是表型多發(fa)生變化，如復(fu)制(zhi)能力(li)、毒力(li)、抗(kang)原性(xing)等，可能的(de)(de)原因(yin)(yin)是由于(yu)缺乏校正功能的(de)(de)聚(ju)合酶存在，而有異質基(ji)因(yin)(yin)的(de)(de)正鏈RNA病毒，在病毒復(fu)制(zhi)中具有較(jiao)高的(de)(de)基(ji)因(yin)(yin)突變率，并且這些突變為了適(shi)應不(bu)同(tong)的(de)(de)宿主細(xi)胞，可能會發(fa)生一(yi)些特(te)性(xing)改變，從而出現一(yi)些預(yu)想(xiang)不(bu)到的(de)(de)結果。
生(sheng)(sheng)長特(te)性(xing)改變 嵌合病毒(du)的(de)(de)兩個母體病毒(du)的(de)(de)易感細(xi)胞(bao)(bao)不同(tong)，得到的(de)(de)嵌合病毒(du)在不同(tong)細(xi)胞(bao)(bao)中(zhong)復制(zhi)時，由于缺乏有效的(de)(de)復制(zhi)酶而引(yin)起生(sheng)(sheng)長特(te)性(xing)的(de)(de)改變，其嗜細(xi)胞(bao)(bao)性(xing)也會有所(suo)改變，另外噬(shi)斑試驗中(zhong)噬(shi)斑形態
生長特性改變
大(da)小都多有(you)變化。如(ru)Chimeri—JE嵌(qian)合體(ti)在(zai)Vero、LLC—MK，、C6/36細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)中(zhong)(zhong)復(fu)制(zhi)形式類似，而(er)在(zai)MRC一(yi)5、FRhl細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)中(zhong)(zhong)雖(sui)然病(bing)毒(du)(du)(du)滴度(du)能(neng)(neng)夠(gou)(gou)達到6log。0pfu/mL，但是卻(que)不能(neng)(neng)產生CPE，這些特性和(he)母(mu)體(ti)株(zhu)YFV以及(ji)JEV都截然不同。LGT1和(he)E5是TBEV的兩個(ge)(ge)弱(ruo)毒(du)(du)(du)株(zhu)，與DEN一(yi)4病(bing)毒(du)(du)(du)組成的嵌(qian)合體(ti)在(zai)猿猴細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)中(zhong)(zhong)復(fu)制(zhi)能(neng)(neng)力下(xia)降，而(er)轉染(ran)蚊蟲細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)復(fu)制(zhi)能(neng)(neng)力不受影響，用(yong)在(zai)蚊蟲細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)傳代的嵌(qian)合病(bing)毒(du)(du)(du)在(zai)猿猴細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)LLC—MK2中(zhong)(zhong)不能(neng)(neng)夠(gou)(gou)形成噬斑，而(er)在(zai)早(zao)期構(gou)建的DEN一(yi)4和(he)另一(yi)個(ge)(ge)TBEV病(bing)毒(du)(du)(du)株(zhu)構(gou)建的嵌(qian)合體(ti)在(zai)猿猴細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)中(zhong)(zhong)卻(que)能(neng)(neng)夠(gou)(gou)得到比(bi)DEN一(yi)4病(bing)毒(du)(du)(du)滴度(du)高1000倍的嵌(qian)合病(bing)毒(du)(du)(du)。
神(shen)(shen)經(jing)內(nei)(nei)毒(du)(du)性(xing)(xing)(xing)(xing)和(he)神(shen)(shen)經(jing)外(wai)毒(du)(du)性(xing)(xing)(xing)(xing) 神(shen)(shen)經(jing)內(nei)(nei)(外(wai))毒(du)(du)性(xing)(xing)(xing)(xing)低而免疫(yi)(yi)(yi)原(yuan)性(xing)(xing)(xing)(xing)好(hao)是(shi)一(yi)(yi)(yi)個理想(xiang)疫(yi)(yi)(yi)苗(miao)應(ying)具(ju)備的(de)(de)品質，許多(duo)實驗室(shi)經(jing)過多(duo)年研究雖然篩檢出一(yi)(yi)(yi)些(xie)(xie)減(jian)毒(du)(du)株(zhu)，但是(shi)兩(liang)(liang)者多(duo)不能(neng)(neng)達到(dao)有效的(de)(de)統(tong)一(yi)(yi)(yi)。嵌(qian)合(he)(he)病毒(du)(du)技(ji)術以“取長補短”的(de)(de)原(yuan)則，將兩(liang)(liang)種(zhong)病毒(du)(du)的(de)(de)免疫(yi)(yi)(yi)原(yuan)性(xing)(xing)(xing)(xing)和(he)毒(du)(du)性(xing)(xing)(xing)(xing)結合(he)(he)起來(lai)(lai)，以期研制理想(xiang)疫(yi)(yi)(yi)苗(miao)，就目前得(de)到(dao)的(de)(de)一(yi)(yi)(yi)些(xie)(xie)嵌(qian)合(he)(he)株(zhu)來(lai)(lai)說，確實取得(de)了一(yi)(yi)(yi)些(xie)(xie)令人滿意(yi)的(de)(de)結果，如DEN一(yi)(yi)(yi)4和(he)WNV的(de)(de)嵌(qian)合(he)(he)病毒(du)(du)與WNV相比高度減(jian)毒(du)(du)四，腦內(nei)(nei)接(jie)種(zhong)戒奶小(xiao)鼠，神(shen)(shen)經(jing)內(nei)(nei)毒(du)(du)性(xing)(xing)(xing)(xing)降低至1/28500；腹(fu)腔內(nei)(nei)接(jie)種(zhong)小(xiao)鼠，神(shen)(shen)經(jing)外(wai)毒(du)(du)性(xing)(xing)(xing)(xing)下降至1/10000，免疫(yi)(yi)(yi)原(yuan)性(xing)(xing)(xing)(xing)好(hao)，能(neng)(neng)安全保護(hu)小(xiao)鼠接(jie)受野(ye)生株(zhu)攻擊。另外(wai)如ChimeriVax—JE嵌(qian)合(he)(he)病毒(du)(du)毒(du)(du)性(xing)(xing)(xing)(xing)也較母體株(zhu)YFV和(he)JEV呈大幅度下降，而單劑量又具(ju)備很好(hao)的(de)(de)免疫(yi)(yi)(yi)保護(hu)力；還(huan)有DEN—TBEV、YFV-DEN、YFV—WNV等嵌(qian)合(he)(he)病毒(du)(du)株(zhu)的(de)(de)毒(du)(du)性(xing)(xing)(xing)(xing)都(dou)有所下降，這些(xie)(xie)嵌(qian)合(he)(he)體都(dou)在進一(yi)(yi)(yi)步的(de)(de)研究中。
神經內毒性(xing)和(he)神經外(wai)毒性(xing)
基因(yin)穩(wen)定(ding)性(xing) 因(yin)為(wei)(wei)RNA病(bing)(bing)毒(du)(du)(du)易(yi)以(yi)準種(zhong)的(de)(de)(de)形式出(chu)現和易(yi)變異的(de)(de)(de)特性(xing)，作為(wei)(wei)活疫苗來使(shi)用，一個重要(yao)的(de)(de)(de)條件(jian)是基因(yin)型要(yao)穩(wen)定(ding)，這一點是疫苗安全性(xing)的(de)(de)(de)重要(yao)表現。嵌(qian)合病(bing)(bing)毒(du)(du)(du)的(de)(de)(de)穩(wen)定(ding)性(xing)主(zhu)要(yao)通過返祖實驗檢定(ding)，即在(zai)(zai)(zai)乳(ru)鼠腦(nao)內和細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)中進行培養，觀察有(you)無明顯表型變化，必(bi)要(yao)時(shi)(shi)進行核苷酸鑒定(ding)，如(ru)ChimeriVax-JE嵌(qian)合病(bing)(bing)毒(du)(du)(du)115．161在(zai)(zai)(zai)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)內傳(chuan)代l8次(ci)以(yi)及(ji)在(zai)(zai)(zai)乳(ru)鼠腦(nao)內傳(chuan)代6次(ci)并沒有(you)毒(du)(du)(du)力的(de)(de)(de)回升(sheng)，對減毒(du)(du)(du)位點進行測序也沒有(you)發生核苷酸改變。而有(you)的(de)(de)(de)嵌(qian)合病(bing)(bing)毒(du)(du)(du)穩(wen)定(ding)性(xing)不(bu)夠好(hao)如(ru)DEN一2/DEN一4、DEN一2/DEN—l復(fu)(fu)制(zhi)(zhi)能力較(jiao)(jiao)弱(ruo)，而經過幾次(ci)傳(chuan)代后(hou)得(de)到較(jiao)(jiao)高(gao)(gao)的(de)(de)(de)病(bing)(bing)毒(du)(du)(du)滴(di)度(du)，是因(yin)為(wei)(wei)發生了一些突變。在(zai)(zai)(zai)體外轉(zhuan)錄時(shi)(shi)產生了轉(zhuan)錄體的(de)(de)(de)雜和體，在(zai)(zai)(zai)轉(zhuan)染后(hou)經過細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)復(fu)(fu)制(zhi)(zhi)，復(fu)(fu)制(zhi)(zhi)能力增強的(de)(de)(de)病(bing)(bing)毒(du)(du)(du)逐(zhu)漸占(zhan)主(zhu)要(yao)優(you)勢，在(zai)(zai)(zai)LLC—MK2細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)中病(bing)(bing)毒(du)(du)(du)傳(chuan)代可(ke)以(yi)保持較(jiao)(jiao)高(gao)(gao)的(de)(de)(de)遺傳(chuan)穩(wen)定(ding)性(xing)，所以(yi)在(zai)(zai)(zai)制(zhi)(zhi)備(bei)嵌(qian)合疫苗時(shi)(shi)，應盡量減少病(bing)(bing)毒(du)(du)(du)在(zai)(zai)(zai)哺乳(ru)動物(wu)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)中傳(chuan)代的(de)(de)(de)次(ci)數(shu)。
基因穩定性
在黃熱病(bing)(bing)毒(du)(du)嵌合(he)病(bing)(bing)毒(du)(du)發展的(de)(de)(de)這(zhe)十(shi)幾年中(zhong)，人們嘗試構(gou)建了多(duo)種嵌合(he)病(bing)(bing)毒(du)(du)，其中(zhong)大部分是以制(zhi)備(bei)疫苗為目的(de)(de)(de)，另外還用(yong)于病(bing)(bing)毒(du)(du)的(de)(de)(de)分子生物學(xue)特性研究(jiu)。
分子生物學(xue)特性研究 型(xing)(xing)內嵌合(he)病(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)(du)(du)可(ke)以用于了解(jie)病(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)(du)(du)復(fu)(fu)制能力，進(jin)一(yi)(yi)步了解(jie)各基(ji)因的功能。如構(gou)建(jian)同型(xing)(xing)不同株(zhu)(zhu)之(zhi)間(jian)(jian)DEN一(yi)(yi)216681/PDK一(yi)(yi)53、DEN25ol/04株(zhu)(zhu)之(zhi)間(jian)(jian)的型(xing)(xing)內嵌合(he)疫苗，研究DEN一(yi)(yi)2型(xing)(xing)病(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)(du)(du)結構(gou)蛋白區(qu)對乳(ru)鼠(shu)神經毒(du)(du)(du)(du)(du)性的影響(xiang)。可(ke)以用于推測病(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)(du)(du)毒(du)(du)(du)(du)(du)力位點(dian)，由2個(ge)JEV病(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)(du)(du)株(zhu)(zhu)cDNA克隆(long)提供5端，3個(ge)病(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)(du)(du)株(zhu)(zhu)cDNA提供的3端進(jin)行(xing)組(zu)合(he)，感染(ran)細(xi)胞后(hou)(hou)重(zhong)新獲得6種重(zhong)組(zu)JEV病(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)(du)(du)。根(gen)據噬菌(jun)斑大小篩選到3個(ge)減毒(du)(du)(du)(du)(du)株(zhu)(zhu)，比(bi)較(jiao)6種重(zhong)組(zu)病(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)(du)(du)株(zhu)(zhu)和野生株(zhu)(zhu)的基(ji)因序列，發(fa)現僅僅是(shi)E138(Glu—Lys)一(yi)(yi)個(ge)氨基(ji)酸位點(dian)不同，說(shuo)明這個(ge)位點(dian)和毒(du)(du)(du)(du)(du)力之(zhi)間(jian)(jian)關系(xi)密切；另外發(fa)現該突變株(zhu)(zhu)雖然毒(du)(du)(du)(du)(du)性降(jiang)低，但是(shi)腦(nao)內注射(she)接(jie)種小鼠(shu)后(hou)(hou)仍能在(zai)腦(nao)內復(fu)(fu)制，但是(shi)病(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)(du)(du)滴度比(bi)較(jiao)低，看來其(qi)減毒(du)(du)(du)(du)(du)機(ji)制不在(zai)于病(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)(du)(du)的復(fu)(fu)制，而可(ke)能是(shi)影響(xiang)復(fu)(fu)制的早期機(ji)制，在(zai)細(xi)胞之(zhi)間(jian)(jian)傳遞速度比(bi)較(jiao)慢，從而使免疫系(xi)統能及時清除病(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)(du)(du)。
分子生物學(xue)特性研究
型間嵌合(he)病(bing)毒(du)(du)(du)也可以(yi)用(yong)于分子生物學(xue)特性(xing)(xing)的(de)(de)研究，如(ru)(ru)黃(huang)熱(re)病(bing)毒(du)(du)(du)和(he)日本腦炎病(bing)毒(du)(du)(du)雖(sui)然(ran)同(tong)(tong)屬(shu)黃(huang)熱(re)病(bing)毒(du)(du)(du)屬(shu)，但是有很(hen)(hen)多生物學(xue)特性(xing)(xing)都(dou)(dou)不盡(jin)相(xiang)(xiang)(xiang)同(tong)(tong)，如(ru)(ru)抗原(yuan)性(xing)(xing)相(xiang)(xiang)(xiang)差很(hen)(hen)遠、中間宿主不同(tong)(tong)、引(yin)起人體發(fa)病(bing)的(de)(de)癥狀也截然(ran)不同(tong)(tong)；兩者雖(sui)然(ran)從同(tong)(tong)一病(bing)毒(du)(du)(du)得來(lai)，但是在進化(hua)(hua)的(de)(de)過程中發(fa)生了很(hen)(hen)大的(de)(de)變化(hua)(hua)，構建的(de)(de)嵌合(he)病(bing)毒(du)(du)(du)YF/JE(S)其(qi)(qi)生物學(xue)特性(xing)(xing)也有所改(gai)變，如(ru)(ru)神(shen)經內(nei)毒(du)(du)(du)性(xing)(xing)和(he)神(shen)經外毒(du)(du)(du)性(xing)(xing)都(dou)(dou)有所降低，和(he)其(qi)(qi)供(gong)體株(zhu)SAl4一l4—2相(xiang)(xiang)(xiang)似；而構建的(de)(de)另一個(ge)嵌合(he)株(zhu)YF/JE(N)神(shen)經毒(du)(du)(du)性(xing)(xing)卻(que)很(hen)(hen)高(gao)，和(he)供(gong)體株(zhu)Nakayama特性(xing)(xing)一致；這(zhe)說明確實如(ru)(ru)原(yuan)先預(yu)料，和(he)減(jian)毒(du)(du)(du)有關的(de)(de)表位主要存在E蛋(dan)白(bai)中，而同(tong)(tong)時也發(fa)現，和(he)原(yuan)來(lai)的(de)(de)SA14-14-2相(xiang)(xiang)(xiang)比較(jiao)，嵌合(he)株(zhu)在細胞中復制能力升高(gao)，病(bing)毒(du)(du)(du)滴(di)度較(jiao)高(gao)，免疫原(yuan)性(xing)(xing)增加(jia)，這(zhe)又(you)說明是YF一17DD病(bing)毒(du)(du)(du)的(de)(de)非結構蛋(dan)白(bai)發(fa)揮作用(yong)。
候選疫苗 ChimeriVax-JE嵌合(he)病毒
候選疫苗
日(ri)本腦(nao)炎是一(yi)(yi)種影(ying)響(xiang)中(zhong)(zhong)樞(shu)神經(jing)系統(tong)的(de)(de)(de)疾(ji)病(bing)(bing)(bing)(bing)，主要流(liu)行于(yu)亞洲，但是近(jin)年在(zai)澳(ao)洲、美洲也有(you)病(bing)(bing)(bing)(bing)例發(fa)生(sheng)，每年官方報道(dao)全(quan)球有(you)5萬病(bing)(bing)(bing)(bing)例，其中(zhong)(zhong)有(you)l萬例是致死性(xing)的(de)(de)(de)；雖然目(mu)前(qian)(qian)有(you)活疫(yi)苗(miao)、滅活疫(yi)苗(miao)的(de)(de)(de)使用(yong)，但是這(zhe)些(xie)疫(yi)苗(miao)具(ju)有(you)免疫(yi)原性(xing)不(bu)夠、價格偏高、制(zhi)作工藝不(bu)被WHO認(ren)可(ke)等劣勢，所以(yi)還有(you)必要開發(fa)研制(zhi)新疫(yi)苗(miao)。1999年Chambers等以(yi)SA14-14-2的(de)(de)(de)prM和(he)E基因代替YF一(yi)(yi)17DD疫(yi)苗(miao)株的(de)(de)(de)相應基因構建了嵌合(he)病(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)ChimeriVax—JE15,16,，該病(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)能在(zai)WHO認(ren)可(ke)的(de)(de)(de)細胞中(zhong)(zhong)很(hen)好地被培(pei)養，恢復病(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)和(he)YF一(yi)(yi)17DD、SA14—14-2相比較，以(yi)6log0pfu的(de)(de)(de)嵌合(he)病(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)腦(nao)內接種3-4周齡小(xiao)鼠(shu)(shu)無一(yi)(yi)例發(fa)病(bing)(bing)(bing)(bing)，而接種YF-17DD的(de)(de)(de)小(xiao)鼠(shu)(shu)全(quan)部(bu)死亡；另外用(yong)3．2log0pfu劑量的(de)(de)(de)SA14-14-2接種，能在(zai)85%一(yi)(yi)95%的(de)(de)(de)接種者(zhe)中(zhong)(zhong)產生(sheng)中(zhong)(zhong)和(he)抗(kang)體(ti)，抗(kang)體(ti)平均滴度能夠達到(dao)PRNT~o<30，血(xue)清陽轉(zhuan)率小(xiao)于(yu)80%；而接種4~51og0pfu的(de)(de)(de)嵌合(he)疫(yi)苗(miao)后(hou)，能夠達到(dao)100%的(de)(de)(de)血(xue)清陽轉(zhuan)率，接種后(hou)30dPRNT能夠達到(dao)129~327，這(zhe)些(xie)結果表明(ming)構建的(de)(de)(de)嵌合(he)病(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)神經(jing)內毒(du)(du)(du)性(xing)呈大幅度降低；用(yong)乳鼠(shu)(shu)以(yi)及猴子(zi)進行安全(quan)試(shi)驗(yan)檢(jian)測，進一(yi)(yi)步證(zheng)實(shi)了該病(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)的(de)(de)(de)弱(ruo)神經(jing)毒(du)(du)(du)性(xing)，內臟毒(du)(du)(du)性(xing)也下降。目(mu)前(qian)(qian)該疫(yi)苗(miao)已經(jing)通(tong)過一(yi)(yi)期臨床試(shi)驗(yan)，是很(hen)有(you)前(qian)(qian)途的(de)(de)(de)疫(yi)苗(miao)候選(xuan)株。
登革(ge)病毒多價疫苗(miao)
登(deng)革病(bing)(bing)毒(du)(du)是(shi)目(mu)前誘發(fa)疾病(bing)(bing)最(zui)多的(de)(de)黃熱病(bing)(bing)毒(du)(du)，在人口(kou)聚集的(de)(de)熱帶及(ji)亞(ya)熱帶時有(you)爆發(fa)，因為登(deng)革病(bing)(bing)毒(du)(du)4個血清型(xing)之間(jian)可(ke)以產生(sheng)交(jiao)叉保護力(li)(li)，所以感(gan)染(ran)一(yi)種(zhong)病(bing)(bing)毒(du)(du)后，能(neng)夠(gou)對另外3種(zhong)血清型(xing)病(bing)(bing)毒(du)(du)的(de)(de)抗體反應(ying)。在機體遭受另一(yi)種(zhong)血清型(xing)病(bing)(bing)毒(du)(du)的(de)(de)感(gan)染(ran)后，由于抗體依賴(lai)的(de)(de)復制能(neng)力(li)(li)增強作用可(ke)能(neng)誘發(fa)DHF/DSS的(de)(de)發(fa)生(sheng)，因此理想的(de)(de)疫(yi)苗(miao)應(ying)該能(neng)夠(gou)產生(sheng)針對4個型(xing)病(bing)(bing)毒(du)(du)的(de)(de)中和(he)(he)抗體和(he)(he)T細胞免(mian)疫(yi)。目(mu)前主要有(you)兩個實(shi)(shi)驗(yan)(yan)(yan)室分別以DEN一(yi)2PDK一(yi)53和(he)(he)YF一(yi)17DD作為受體株(zhu)構建了包括DEN一(yi)1到DEN-4型(xing)的(de)(de)嵌合株(zhu)，結果有(you)很好的(de)(de)免(mian)疫(yi)原(yuan)性、較高的(de)(de)復制效率(lv)和(he)(he)穩定(ding)性，在動(dong)物實(shi)(shi)驗(yan)(yan)(yan)中證明毒(du)(du)性減低，小鼠效力(li)(li)實(shi)(shi)驗(yan)(yan)(yan)安全(quan)有(you)效，有(you)望成為登(deng)革病(bing)(bing)毒(du)(du)疫(yi)苗(miao)的(de)(de)發(fa)展方向(xiang)。
另外還(huan)有(you)YF/TBE、YF/WNV、DEN4/TBE的(de)報道，都出現一些令人滿意(yi)的(de)特性(xing)，進一步研究(jiu)正(zheng)在進行中。嵌合(he)(he)病毒(du)的(de)出現是獲得(de)減毒(du)活疫苗的(de)一個新(xin)途徑，和傳統方法(fa)相比(bi)具(ju)有(you)目標明(ming)確(que)、免疫效果好、減毒(du)穩定(ding)的(de)優勢，但該技術目前還(huan)處(chu)于探索階段(duan)，有(you)時(shi)(shi)結果很出人意(yi)料，所(suo)以在構建(jian)一個新(xin)的(de)嵌合(he)(he)體(ti)時(shi)(shi)，要時(shi)(shi)刻注意(yi)安全(quan)性(xing)問題，否則(ze)會(hui)適得(de)其反，創造出新(xin)的(de)毒(du)性(xing)更強的(de)病毒(du)，為人類帶(dai)來危害(hai)。
嵌(qian)(qian)合(he)疫(yi)(yi)苗(miao)是應(ying)用基因工程手段構建基因能表(biao)達兩種(zhong)以(yi)上病(bing)原體抗原的一(yi)類(lei)新型(xing)疫(yi)(yi)苗(miao),應(ying)用嵌(qian)(qian)合(he)疫(yi)(yi)苗(miao)可(ke)解決多次接種(zhong)問(wen)題。本文綜(zong)述了(le)目前世界一(yi)些國家研制的嵌(qian)(qian)合(he)疫(yi)(yi)苗(miao),如登革(ge)病(bing)毒(du)、乙型(xing)腦炎病(bing)毒(du)、呼吸道合(he)胞病(bing)毒(du)、副流感病(bing)毒(du)、人類(lei)免(mian)疫(yi)(yi)缺陷(xian)病(bing)病(bing)毒(du)及人乳頭(tou)瘤病(bing)毒(du)等相關嵌(qian)(qian)合(he)疫(yi)(yi)苗(miao)的研究策略和方法、免(mian)疫(yi)(yi)學(xue)評價及其應(ying)用前景。
精靈世界
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