美洲(zhou)大赤魷(you)(DosidicusGigas)在(zai)食品(pin)加工(gong)過(guo)程中(zhong)(zhong)的(de)(de)(de)(de)軟骨廢棄物(wu)為(wei)(wei)原料,建(jian)立(li)包括(kuo)粉碎、脫水脫脂(zhi)、酶(mei)解(jie)、除蛋白(bai)(bai)、醇沉(chen)、離子(zi)交換、脫鹽(yan)等操(cao)作流程的(de)(de)(de)(de)CS制(zhi)備(bei)方法(fa),制(zhi)備(bei)得到新(xin)(xin)(xin)型CS。最終(zhong)產品(pin)的(de)(de)(de)(de)產率(lv)達(da)到16±2%。用(yong)(yong)(yong)(yong)商品(pin)化(hua)的(de)(de)(de)(de)硫(liu)(liu)酸(suan)軟骨素(su)ABC酶(mei)、硫(liu)(liu)酸(suan)皮膚素(su)酶(mei)、透(tou)明質酸(suan)酶(mei)(來(lai)自(zi)于(yu)StreptomycesHyalurolyticus)、以及實(shi)驗(yan)室自(zi)有產權(quan)的(de)(de)(de)(de)rHCLase降(jiang)解(jie)所得多(duo)糖(tang),根據酶(mei)的(de)(de)(de)(de)底(di)物(wu)專一性,確認所制(zhi)備(bei)的(de)(de)(de)(de)多(duo)糖(tang)為(wei)(wei)CS；通過(guo)咔唑反(fan)應檢(jian)測樣(yang)品(pin)中(zhong)(zhong)新(xin)(xin)(xin)型CS含(han)(han)(han)(han)量(liang)(liang),BCA蛋白(bai)(bai)定量(liang)(liang)法(fa)檢(jian)測樣(yang)品(pin)中(zhong)(zhong)蛋白(bai)(bai)含(han)(han)(han)(han)量(liang)(liang)。結(jie)果(guo)提示(shi)：樣(yang)品(pin)中(zhong)(zhong)新(xin)(xin)(xin)型CS含(han)(han)(han)(han)量(liang)(liang)達(da)到97%以上,蛋白(bai)(bai)含(han)(han)(han)(han)量(liang)(liang)低于(yu)2%。2.新(xin)(xin)(xin)型CS多(duo)糖(tang)結(jie)構的(de)(de)(de)(de)初步(bu)分(fen)(fen)(fen)(fen)析(xi)(xi)：參照葡(pu)聚(ju)糖(tang)分(fen)(fen)(fen)(fen)子(zi)量(liang)(liang)標準物(wu),經凝膠過(guo)濾(lv)HPLC分(fen)(fen)(fen)(fen)析(xi)(xi),確定所制(zhi)備(bei)的(de)(de)(de)(de)NER-CS多(duo)糖(tang)平(ping)均分(fen)(fen)(fen)(fen)子(zi)量(liang)(liang)約為(wei)(wei)623.2 kDa。再通過(guo)硫(liu)(liu)酸(suan)軟骨素(su)ABC酶(mei)完(wan)全降(jiang)解(jie),結(jie)合HPLC分(fen)(fen)(fen)(fen)析(xi)(xi)二糖(tang)組成,發現NER-CS主要含(han)(han)(han)(han)有GlcAβ1-3GalNAcGlcAβ1-3GalNAc(4S)、GlcAβ1-3GalNAc(6S)、E-unit,其(qi)中(zhong)(zhong)E-unit含(han)(han)(han)(han)量(liang)(liang)最高(gao)可達(da)44.5%,同時(shi)GlcAp1-3GalNAc、GlcAβ1-3GalNAc(4S)]、GlcAβ1-3GalNAc(6S)]含(han)(han)(han)(han)量(liang)(liang)分(fen)(fen)(fen)(fen)別(bie)(bie)為(wei)(wei)7.1%、12.6%、35.8%,總硫(liu)(liu)酸(suan)化(hua)度為(wei)(wei)1.37。是一種(zhong)新(xin)(xin)(xin)型高(gao)硫(liu)(liu)酸(suan)化(hua)CS。3NER-CS生物(wu)活(huo)性的(de)(de)(de)(de)初步(bu)分(fen)(fen)(fen)(fen)析(xi)(xi)：1)用(yong)(yong)(yong)(yong)Aglyco試劑(ji)盒檢(jian)測NER-CS的(de)(de)(de)(de)抗凝血活(huo)性,結(jie)果(guo)顯(xian)(xian)示(shi)：NER-CS抗FⅡa和(he)抗FXa活(huo)性分(fen)(fen)(fen)(fen)別(bie)(bie)為(wei)(wei)20±2U/mg和(he)0.9±0.2U/mg,是陽性對(dui)照肝素(su)抗FⅡa活(huo)性的(de)(de)(de)(de)10%左右,抗FXa活(huo)性的(de)(de)(de)(de)4%左右；2)利用(yong)(yong)(yong)(yong)乳腺癌4T1細胞試驗(yan)轉(zhuan)移模型,分(fen)(fen)(fen)(fen)析(xi)(xi)NER-CS在(zai)小鼠體內抗腫瘤轉(zhuan)移活(huo)性,結(jie)果(guo)顯(xian)(xian)示(shi)：50、100和(he)200μgNER-CS的(de)(de)(de)(de)抑瘤率(lv)分(fen)(fen)(fen)(fen)別(bie)(bie)為(wei)(wei)54.3±2.5%、75.1±3.5%、42.9±2.1%,同時(shi)陽性對(dui)照100μg肝素(su)的(de)(de)(de)(de)抑瘤率(lv)為(wei)(wei)74.6±1.8%；3)用(yong)(yong)(yong)(yong)親和(he)素(su)修飾(shi)的(de)(de)(de)(de)CM5芯片固定生物(wu)素(su)化(hua)NER-CS,分(fen)(fen)(fen)(fen)析(xi)(xi)NER-CS與五種(zhong)生長因子(zi)、三種(zhong)選擇素(su)的(de)(de)(de)(de)相(xiang)(xiang)互(hu)作用(yong)(yong)(yong)(yong)活(huo)性,結(jie)果(guo)顯(xian)(xian)示(shi)NER-CS與生長因子(zi)HGF、bFGF相(xiang)(xiang)互(hu)作用(yong)(yong)(yong)(yong)活(huo)性較高(gao),親和(he)力常數分(fen)(fen)(fen)(fen)別(bie)(bie)為(wei)(wei)(3.47±1.73)x10-6、(5.39±2.92)x10-8。4.NER-CS寡糖(tang)的(de)(de)(de)(de)制(zhi)備(bei)及其(qi)抗腫瘤活(huo)性分(fen)(fen)(fen)(fen)析(xi)(xi)。
