美洲大(da)赤魷(DosidicusGigas)在(zai)食(shi)品(pin)加工過程中的(de)(de)(de)軟(ruan)骨廢(fei)棄物(wu)為(wei)(wei)(wei)原(yuan)料,建(jian)立包括粉(fen)碎(sui)、脫(tuo)(tuo)水(shui)脫(tuo)(tuo)脂、酶解(jie)、除蛋白(bai)、醇(chun)沉、離子交(jiao)換、脫(tuo)(tuo)鹽等操作流程的(de)(de)(de)CS制(zhi)備方(fang)法,制(zhi)備得(de)(de)到(dao)新(xin)型(xing)CS。最(zui)終產品(pin)的(de)(de)(de)產率達(da)到(dao)16±2%。用(yong)(yong)(yong)商(shang)品(pin)化(hua)的(de)(de)(de)硫(liu)(liu)(liu)酸(suan)軟(ruan)骨素(su)(su)(su)ABC酶、硫(liu)(liu)(liu)酸(suan)皮膚素(su)(su)(su)酶、透明質酸(suan)酶(來自(zi)于StreptomycesHyalurolyticus)、以及實驗室自(zi)有產權(quan)的(de)(de)(de)rHCLase降(jiang)解(jie)所(suo)得(de)(de)多(duo)糖(tang)(tang)(tang),根據酶的(de)(de)(de)底物(wu)專一性(xing)(xing)(xing),確認所(suo)制(zhi)備的(de)(de)(de)多(duo)糖(tang)(tang)(tang)為(wei)(wei)(wei)CS；通過咔唑反應檢(jian)測樣品(pin)中新(xin)型(xing)CS含(han)量(liang)(liang)(liang),BCA蛋白(bai)定(ding)量(liang)(liang)(liang)法檢(jian)測樣品(pin)中蛋白(bai)含(han)量(liang)(liang)(liang)。結(jie)(jie)(jie)果(guo)(guo)提示：樣品(pin)中新(xin)型(xing)CS含(han)量(liang)(liang)(liang)達(da)到(dao)97%以上,蛋白(bai)含(han)量(liang)(liang)(liang)低于2%。2.新(xin)型(xing)CS多(duo)糖(tang)(tang)(tang)結(jie)(jie)(jie)構的(de)(de)(de)初(chu)步分(fen)(fen)(fen)析(xi)(xi)(xi)：參照(zhao)葡聚糖(tang)(tang)(tang)分(fen)(fen)(fen)子量(liang)(liang)(liang)標準(zhun)物(wu),經凝膠過濾HPLC分(fen)(fen)(fen)析(xi)(xi)(xi),確定(ding)所(suo)制(zhi)備的(de)(de)(de)NER-CS多(duo)糖(tang)(tang)(tang)平(ping)均(jun)分(fen)(fen)(fen)子量(liang)(liang)(liang)約為(wei)(wei)(wei)623.2 kDa。再通過硫(liu)(liu)(liu)酸(suan)軟(ruan)骨素(su)(su)(su)ABC酶完全降(jiang)解(jie),結(jie)(jie)(jie)合HPLC分(fen)(fen)(fen)析(xi)(xi)(xi)二糖(tang)(tang)(tang)組成,發(fa)現NER-CS主要含(han)有GlcAβ1-3GalNAcGlcAβ1-3GalNAc(4S)、GlcAβ1-3GalNAc(6S)、E-unit,其(qi)(qi)中E-unit含(han)量(liang)(liang)(liang)最(zui)高(gao)可達(da)44.5%,同時GlcAp1-3GalNAc、GlcAβ1-3GalNAc(4S)]、GlcAβ1-3GalNAc(6S)]含(han)量(liang)(liang)(liang)分(fen)(fen)(fen)別為(wei)(wei)(wei)7.1%、12.6%、35.8%,總硫(liu)(liu)(liu)酸(suan)化(hua)度為(wei)(wei)(wei)1.37。是(shi)一種新(xin)型(xing)高(gao)硫(liu)(liu)(liu)酸(suan)化(hua)CS。3NER-CS生(sheng)(sheng)物(wu)活(huo)(huo)(huo)性(xing)(xing)(xing)的(de)(de)(de)初(chu)步分(fen)(fen)(fen)析(xi)(xi)(xi)：1)用(yong)(yong)(yong)Aglyco試劑(ji)盒檢(jian)測NER-CS的(de)(de)(de)抗凝血活(huo)(huo)(huo)性(xing)(xing)(xing),結(jie)(jie)(jie)果(guo)(guo)顯示：NER-CS抗FⅡa和抗FXa活(huo)(huo)(huo)性(xing)(xing)(xing)分(fen)(fen)(fen)別為(wei)(wei)(wei)20±2U/mg和0.9±0.2U/mg,是(shi)陽性(xing)(xing)(xing)對(dui)(dui)照(zhao)肝素(su)(su)(su)抗FⅡa活(huo)(huo)(huo)性(xing)(xing)(xing)的(de)(de)(de)10%左(zuo)右(you),抗FXa活(huo)(huo)(huo)性(xing)(xing)(xing)的(de)(de)(de)4%左(zuo)右(you)；2)利用(yong)(yong)(yong)乳腺(xian)癌(ai)4T1細胞試驗轉移(yi)模型(xing),分(fen)(fen)(fen)析(xi)(xi)(xi)NER-CS在(zai)小鼠體內抗腫瘤轉移(yi)活(huo)(huo)(huo)性(xing)(xing)(xing),結(jie)(jie)(jie)果(guo)(guo)顯示：50、100和200μgNER-CS的(de)(de)(de)抑瘤率分(fen)(fen)(fen)別為(wei)(wei)(wei)54.3±2.5%、75.1±3.5%、42.9±2.1%,同時陽性(xing)(xing)(xing)對(dui)(dui)照(zhao)100μg肝素(su)(su)(su)的(de)(de)(de)抑瘤率為(wei)(wei)(wei)74.6±1.8%；3)用(yong)(yong)(yong)親和素(su)(su)(su)修(xiu)飾的(de)(de)(de)CM5芯片固定(ding)生(sheng)(sheng)物(wu)素(su)(su)(su)化(hua)NER-CS,分(fen)(fen)(fen)析(xi)(xi)(xi)NER-CS與五(wu)種生(sheng)(sheng)長因(yin)子、三種選擇素(su)(su)(su)的(de)(de)(de)相互作用(yong)(yong)(yong)活(huo)(huo)(huo)性(xing)(xing)(xing),結(jie)(jie)(jie)果(guo)(guo)顯示NER-CS與生(sheng)(sheng)長因(yin)子HGF、bFGF相互作用(yong)(yong)(yong)活(huo)(huo)(huo)性(xing)(xing)(xing)較高(gao),親和力常數分(fen)(fen)(fen)別為(wei)(wei)(wei)(3.47±1.73)x10-6、(5.39±2.92)x10-8。4.NER-CS寡糖(tang)(tang)(tang)的(de)(de)(de)制(zhi)備及其(qi)(qi)抗腫瘤活(huo)(huo)(huo)性(xing)(xing)(xing)分(fen)(fen)(fen)析(xi)(xi)(xi)。
