一、膠原酶簡介

膠原酶(mei)按其存在的(de)(de)方式不(bu)同可(ke)分為(wei)人體內(nei)(nei)源性(xing)膠原酶(mei)和藥用膠原酶(mei)兩種(zhong)。人體內(nei)(nei)源性(xing)膠原酶(mei)是指人體內(nei)(nei)部本身所具有(you)的(de)(de)膠原酶(mei)，如牙齦、觸膜(mo)等上皮組(zu)(zu)織(zhi)和關(guan)節滑膜(mo)、椎(zhui)間盤內(nei)(nei)都(dou)不(bu)同程度的(de)(de)存在著這種(zhong)膠原酶(mei)，它在體內(nei)(nei)膠原蛋(dan)白(bai)的(de)(de)分解過程中(zhong)發揮著不(bu)可(ke)或(huo)缺的(de)(de)作用。藥用膠原酶(mei)是指利用生(sheng)物制藥的(de)(de)高科(ke)技手段從(cong)溶(rong)組(zu)(zu)織(zhi)梭狀(zhuang)芽孢桿菌的(de)(de)發酵液中(zhong)提取、純化并精(jing)制而得(de)的(de)(de)白(bai)色或(huo)類白(bai)色無菌凍干粉針(zhen)生(sheng)物制劑。

膠(jiao)(jiao)原(yuan)酶（collagenase）是從溶組織(zhi)(zhi)(zhi)梭狀(zhuang)細(xi)(xi)胞(bao)芽孢桿菌提(ti)取制備的，主要(yao)(yao)水解結締(di)組織(zhi)(zhi)(zhi)中膠(jiao)(jiao)原(yuan)蛋(dan)(dan)白成(cheng)分(fen)(fen)。當(dang)擬消(xiao)(xiao)化(hua)的組織(zhi)(zhi)(zhi)較(jiao)硬，內含較(jiao)多(duo)結締(di)組織(zhi)(zhi)(zhi)或膠(jiao)(jiao)原(yuan)成(cheng)分(fen)(fen)時(shi)，用胰蛋(dan)(dan)白酶解離(li)細(xi)(xi)胞(bao)的效(xiao)果較(jiao)差，這時(shi)可(ke)(ke)采用膠(jiao)(jiao)原(yuan)酶解離(li)細(xi)(xi)胞(bao)法。 膠(jiao)(jiao)原(yuan)酶僅對細(xi)(xi)胞(bao)間質有消(xiao)(xiao)化(hua)作用而(er)對上(shang)皮(pi)細(xi)(xi)胞(bao)影(ying)響(xiang)不大。因此適(shi)于消(xiao)(xiao)化(hua)分(fen)(fen)離(li)纖維性組織(zhi)(zhi)(zhi)、上(shang)皮(pi)及癌組織(zhi)(zhi)(zhi)，可(ke)(ke)使上(shang)皮(pi)細(xi)(xi)胞(bao)與(yu)膠(jiao)(jiao)原(yuan)成(cheng)分(fen)(fen)分(fen)(fen)離(li)而(er)不受損害。常用劑(ji)量為(wei)(wei)最終濃(nong)度200U/ml（約為(wei)(wei)1mg/mL）或0.03%~0.3%。膠(jiao)(jiao)原(yuan)酶分(fen)(fen)為(wei)(wei)Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ型(xing)(xing)以及肝(gan)細(xi)(xi)胞(bao)專用膠(jiao)(jiao)原(yuan)酶，要(yao)(yao)根(gen)據(ju)所(suo)要(yao)(yao)分(fen)(fen)離(li)消(xiao)(xiao)化(hua)的組織(zhi)(zhi)(zhi)類(lei)(lei)型(xing)(xing)選擇膠(jiao)(jiao)原(yuan)酶類(lei)(lei)型(xing)(xing)。

1、膠原酶(mei)Ⅰ用于上皮、肺，脂肪(fang)和腎(shen)上腺(xian)組織(zhi)細(xi)胞(bao)的(de)分離(li)。用于消(xiao)化組織(zhi)中連接部分使其成為單(dan)個細(xi)胞(bao)，用于哺乳動細(xi)胞(bao)的(de)分離(li)。

2、膠原酶Ⅳ包含至少(shao)7種蛋白酶成分，分子量從(cong)68-130KD不(bu)等。它(ta)能(neng)消化多種組織。

3、膠原(yuan)酶(mei)Ⅴ包含至(zhi)少7種(zhong)蛋白(bai)酶(mei)成分(fen)，分(fen)子(zi)量(liang)從68-130KD不等。它可用于胰腺小島組織的分(fen)離，將結締組織分(fen)離成單個細胞(bao)。

4、膠原酶Ⅱ適用(yong)于肝臟(zang)(zang)，骨，甲狀腺，心臟(zang)(zang)和(he)唾(tuo)液腺組織。

二、如何配置膠原酶

膠原酶溶(rong)液同胰(yi)蛋白酶一樣配制、消毒滅菌和儲藏。

注意(yi)：因(yin)為(wei)Ⅰ型膠原酶(mei)分(fen)子(zi)(zi)顆粒(li)比胰酶(mei)大，不容(rong)易過濾，因(yin)此可(ke)以用蔡式濾器過濾除菌(jun)。 　　鈣、鎂離子(zi)(zi)和血(xue)清成分(fen)不會影響膠原酶(mei)的(de)消化作用，因(yin)而可(ke)用BSS（如D-hanks或者PBS）或含血(xue)清的(de)培養液(ye)配制。

三、膠原酶的使用

1、將漂洗(xi)、修(xiu)剪(jian)干凈的(de)組織剪(jian)成(cheng)1~2mm左右小塊。

2、將組織塊放入離心管(guan)（三角燒(shao)瓶(ping)）中加(jia)入30~50倍體(ti)積的膠原酶溶液(ye)，旋緊(jin)蓋子（密封燒(shao)瓶(ping)）。

3、將(jiang)燒瓶放(fang)入37℃水浴或(huo)者37℃孵箱內，每隔3min振搖(yao)一次，如(ru)能放(fang)在37℃的(de)恒溫震蕩(dang)(dang)水浴箱中則(ze)更好。消(xiao)(xiao)(xiao)(xiao)化時間與(yu)組(zu)織(zhi)(zhi)的(de)類(lei)別很有(you)關系，對(dui)于(yu)某些腫瘤組(zu)織(zhi)(zhi)或(huo)其他較致密結締(di)組(zu)織(zhi)(zhi)，消(xiao)(xiao)(xiao)(xiao)化時間4~48h，對(dui)于(yu)容(rong)易消(xiao)(xiao)(xiao)(xiao)化的(de)組(zu)織(zhi)(zhi)可以(yi)(yi)采用37℃震蕩(dang)(dang)消(xiao)(xiao)(xiao)(xiao)化15~45min，也可以(yi)(yi)根據具體情況而(er)定。如(ru)組(zu)織(zhi)(zhi)塊(kuai)已分散(san)(san)而(er)失(shi)去塊(kuai)的(de)形狀，一經(jing)搖(yao)動即成細(xi)胞(bao)團(tuan)或(huo)單個(ge)細(xi)胞(bao)，可以(yi)(yi)認為已消(xiao)(xiao)(xiao)(xiao)化充(chong)分。上(shang)皮組(zu)織(zhi)(zhi)經(jing)膠原(yuan)酶消(xiao)(xiao)(xiao)(xiao)化后，由于(yu)上(shang)皮細(xi)胞(bao)對(dui)此酶有(you)耐受性，可能仍有(you)一些細(xi)胞(bao)團(tuan)未完全分散(san)(san)，但成團(tuan)的(de)上(shang)皮細(xi)胞(bao)比(bi)分散(san)(san)的(de)單個(ge)上(shang)皮細(xi)胞(bao)更易生長，因此，如(ru)無特殊需(xu)要可以(yi)(yi)不必(bi)再(zai)進一步處(chu)理。

4、收集消(xiao)化液(ye)(ye)（有時含個別組織塊(kuai)及沒(mei)有充分(fen)消(xiao)化的組織碎屑則(ze)需用(yong)100目(mu)不銹鋼(gang)網過濾），離心(xin)1000r/min，5min，去除上(shang)清，用(yong)Hanks液(ye)(ye)或者(zhe)無血清培養液(ye)(ye)離心(xin)漂洗1~2次，去除上(shang)清，加培養液(ye)(ye)制成細胞懸液(ye)(ye)，接種培養瓶(ping)。