一、膠原酶簡介

膠(jiao)原(yuan)(yuan)酶(mei)按其存在(zai)的方式不(bu)同可分為人體(ti)(ti)內(nei)源性膠(jiao)原(yuan)(yuan)酶(mei)和(he)藥用(yong)膠(jiao)原(yuan)(yuan)酶(mei)兩(liang)種。人體(ti)(ti)內(nei)源性膠(jiao)原(yuan)(yuan)酶(mei)是指人體(ti)(ti)內(nei)部本(ben)身所具(ju)有的膠(jiao)原(yuan)(yuan)酶(mei)，如牙齦(yin)、觸膜等上皮組織和(he)關節滑(hua)膜、椎間盤內(nei)都不(bu)同程度的存在(zai)著(zhu)這種膠(jiao)原(yuan)(yuan)酶(mei)，它在(zai)體(ti)(ti)內(nei)膠(jiao)原(yuan)(yuan)蛋白的分解過(guo)程中發揮著(zhu)不(bu)可或缺(que)的作用(yong)。藥用(yong)膠(jiao)原(yuan)(yuan)酶(mei)是指利用(yong)生(sheng)物制(zhi)藥的高科技手段從溶組織梭狀芽孢桿菌(jun)的發酵液中提(ti)取、純化并精制(zhi)而得(de)的白色(se)或類白色(se)無菌(jun)凍(dong)干粉(fen)針生(sheng)物制(zhi)劑。

膠(jiao)原(yuan)(yuan)酶(mei)(mei)(mei)（collagenase）是從溶組(zu)(zu)織梭狀(zhuang)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)芽孢桿菌提取制備(bei)的(de)(de)，主(zhu)要(yao)水解(jie)結締組(zu)(zu)織中膠(jiao)原(yuan)(yuan)蛋(dan)白成分(fen)。當擬消(xiao)化(hua)(hua)的(de)(de)組(zu)(zu)織較硬(ying)，內(nei)含較多結締組(zu)(zu)織或膠(jiao)原(yuan)(yuan)成分(fen)時，用(yong)(yong)(yong)胰蛋(dan)白酶(mei)(mei)(mei)解(jie)離(li)(li)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)的(de)(de)效果(guo)較差，這時可采用(yong)(yong)(yong)膠(jiao)原(yuan)(yuan)酶(mei)(mei)(mei)解(jie)離(li)(li)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)法。 膠(jiao)原(yuan)(yuan)酶(mei)(mei)(mei)僅(jin)對(dui)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)間質有消(xiao)化(hua)(hua)作用(yong)(yong)(yong)而(er)對(dui)上(shang)皮細(xi)(xi)胞(bao)(bao)影(ying)響(xiang)不大。因(yin)此(ci)適于消(xiao)化(hua)(hua)分(fen)離(li)(li)纖(xian)維(wei)性組(zu)(zu)織、上(shang)皮及癌組(zu)(zu)織，可使(shi)上(shang)皮細(xi)(xi)胞(bao)(bao)與(yu)膠(jiao)原(yuan)(yuan)成分(fen)分(fen)離(li)(li)而(er)不受(shou)損害(hai)。常用(yong)(yong)(yong)劑量為最終濃度200U/ml（約(yue)為1mg/mL）或0.03%~0.3%。膠(jiao)原(yuan)(yuan)酶(mei)(mei)(mei)分(fen)為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ型以及肝(gan)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)專用(yong)(yong)(yong)膠(jiao)原(yuan)(yuan)酶(mei)(mei)(mei)，要(yao)根據所要(yao)分(fen)離(li)(li)消(xiao)化(hua)(hua)的(de)(de)組(zu)(zu)織類型選(xuan)擇(ze)膠(jiao)原(yuan)(yuan)酶(mei)(mei)(mei)類型。

1、膠原酶(mei)Ⅰ用(yong)于(yu)上(shang)皮、肺，脂肪和腎上(shang)腺組(zu)織細(xi)胞的(de)分離。用(yong)于(yu)消化組(zu)織中連接(jie)部(bu)分使(shi)其成為(wei)單(dan)個細(xi)胞，用(yong)于(yu)哺乳動(dong)細(xi)胞的(de)分離。

2、膠原(yuan)酶Ⅳ包含至少7種蛋白酶成分，分子量從68-130KD不等。它能消化多種組織。

3、膠(jiao)原酶(mei)(mei)Ⅴ包含至少7種蛋白酶(mei)(mei)成分(fen)，分(fen)子量從(cong)68-130KD不等。它可(ke)用于(yu)胰腺小島組(zu)織的分(fen)離(li)，將結締組(zu)織分(fen)離(li)成單(dan)個細胞。

4、膠原酶Ⅱ適(shi)用(yong)于肝臟，骨(gu)，甲狀腺，心臟和唾液腺組織。

二、如何配置膠原酶

膠原(yuan)酶溶(rong)液同胰蛋(dan)白酶一樣配制、消毒滅菌和儲藏。

注意(yi)：因(yin)為(wei)Ⅰ型膠(jiao)原(yuan)酶分子(zi)顆(ke)粒比(bi)胰酶大，不容易過濾，因(yin)此可(ke)以用蔡式濾器過濾除菌(jun)。 　　鈣、鎂(mei)離子(zi)和血清(qing)成分不會影(ying)響膠(jiao)原(yuan)酶的消(xiao)化作用，因(yin)而可(ke)用BSS（如(ru)D-hanks或者PBS）或含血清(qing)的培養液配制。

三、膠原酶的使用

1、將漂(piao)洗、修剪干凈的組織剪成1~2mm左(zuo)右小塊。

2、將組織塊放入離心管（三(san)角燒瓶）中加入30~50倍體積的膠原酶(mei)溶液，旋緊蓋子（密封燒瓶）。

3、將(jiang)燒瓶放入37℃水浴或者(zhe)37℃孵箱(xiang)內，每隔3min振搖一次，如(ru)能放在(zai)37℃的(de)恒(heng)溫震蕩水浴箱(xiang)中則更好。消(xiao)化(hua)時間與組織(zhi)(zhi)的(de)類別很有關(guan)系，對于某些(xie)腫(zhong)瘤組織(zhi)(zhi)或其他(ta)較(jiao)致(zhi)密結(jie)締組織(zhi)(zhi)，消(xiao)化(hua)時間4~48h，對于容易消(xiao)化(hua)的(de)組織(zhi)(zhi)可以采(cai)用37℃震蕩消(xiao)化(hua)15~45min，也可以根(gen)據具體情況(kuang)而(er)定。如(ru)組織(zhi)(zhi)塊已分(fen)散而(er)失去塊的(de)形狀，一經搖動(dong)即(ji)成細(xi)胞(bao)團或單個(ge)細(xi)胞(bao)，可以認為(wei)已消(xiao)化(hua)充分(fen)。上(shang)(shang)(shang)皮(pi)組織(zhi)(zhi)經膠原酶消(xiao)化(hua)后，由(you)于上(shang)(shang)(shang)皮(pi)細(xi)胞(bao)對此酶有耐受性，可能仍有一些(xie)細(xi)胞(bao)團未完全分(fen)散，但成團的(de)上(shang)(shang)(shang)皮(pi)細(xi)胞(bao)比(bi)分(fen)散的(de)單個(ge)上(shang)(shang)(shang)皮(pi)細(xi)胞(bao)更易生長(chang)，因此，如(ru)無特殊需要可以不必再進(jin)一步處理。

4、收集消(xiao)化液(ye)（有(you)時含個別組(zu)織(zhi)(zhi)塊及沒有(you)充(chong)分(fen)消(xiao)化的組(zu)織(zhi)(zhi)碎屑則需用100目不(bu)銹(xiu)鋼網過濾），離心(xin)1000r/min，5min，去除(chu)上(shang)清，用Hanks液(ye)或者(zhe)無血清培養液(ye)離心(xin)漂洗(xi)1~2次，去除(chu)上(shang)清，加培養液(ye)制成細胞(bao)懸液(ye)，接(jie)種(zhong)培養瓶。