【基因檢測方法比較】基因檢測方法有哪些 基因檢測技術原理

1、第一代測序

1.1 Sanger測序采用的是直接測序法

1977年(nian)，Frederick Sanger等發明了雙脫氧鏈末端終止法，這一技術隨后成為最為常用的基因測序技術。2001年，Allan Maxam和(he)Walter Gibert發明了Sanger測序法，并在此后的10年里成為基因檢測的(de)金標準。其基本原理(li)即雙脫氧核苷三(san)磷酸(dideoxyribonucleoside triphosphate，ddNTP)缺乏PCR延伸所需的3'-OH，因此每當DNA鏈加入分子(zi)ddNTP，延伸(shen)便終止(zhi)。每一次DNA測(ce)序是由4個獨立的反(fan)應組成，將模板(ban)、引(yin)物和4種(zhong)含(han)有不同的放(fang)射性同位素標記(ji)的核(he)苷(gan)酸的ddNTP分(fen)別與DNA聚合(he)酶混合(he)形成長短(duan)不一(yi)的(de)片段，大量起始點(dian)相同、終止(zhi)點(dian)不同的(de)DNA片段存在于反應體系(xi)中，具有單個堿基差別的DNA序列可以被聚丙烯(xi)酰胺(an)變(bian)性凝膠電泳(yong)(yong)分離出來，得到放射性同(tong)位素自顯影條(tiao)帶。依據電泳(yong)(yong)條(tiao)帶讀(du)取DNA雙鏈的堿(jian)基序列。

人類基因(yin)組的測(ce)序正是基于該技(ji)術完成(cheng)的。Sanger測序這種直接(jie)測序方(fang)法具有高度的準(zhun)確性(xing)和簡單、快捷等(deng)特點。目前，依然對于(yu)一些臨床上小樣本遺傳疾病基因(yin)的鑒定具有很高的實用(yong)價(jia)值。例如，臨床上采用(yong)Sanger直接測(ce)序FGFR 2基因(yin)證實單(dan)基因(yin)Apert綜(zong)合征和直接測序TCOF1基因可以檢出多達90%的與(yu)Treacher Collins綜合(he)征(zheng)相關的(de)突變。值得注意的(de)是(shi)，Sanger測序是(shi)針對已知致病基因的突變位點設(she)計引物，進行PCR直(zhi)接擴(kuo)(kuo)增(zeng)測序。單(dan)個突(tu)變(bian)點的擴(kuo)(kuo)增(zeng)包括該位點在內的外顯(xian)子片段即可，不必(bi)將該點所在基(ji)因(yin)的全部外顯(xian)子都擴(kuo)(kuo)增(zeng)。

因此，應明(ming)確定(ding)位要擴增(zeng)的(de)位點所(suo)在的(de)基因外顯子和(he)該(gai)點的(de)具體位置，設計包括該(gai)點在內(nei)的(de)上下游150~200 bp的外顯子片(pian)段引物。此外，盡管有NGS的(de)出現(xian)，但(dan)Sanger測序(xu)對于有致病(bing)(bing)基(ji)因位點明確并且數量有限(xian)的單基(ji)因遺傳疾病(bing)(bing)的致病(bing)(bing)基(ji)因的檢(jian)測是非常經濟和高(gao)效的。到目前(qian)為止，Sanger測(ce)序仍然是作為基因檢測(ce)的金標(biao)準，也(ye)是NGS基因檢(jian)測后進行家系內(nei)和正(zheng)常對照組驗證的主要手(shou)段。

值得注(zhu)意的是，Sanger測(ce)序(xu)目(mu)的(de)是尋找與疾病(bing)有關的(de)特定的(de)基因(yin)(yin)突變。對(dui)于沒有明確候選基因(yin)(yin)或候選基因(yin)(yin)數(shu)量較多的(de)大樣本病(bing)例篩查是難以完(wan)成的(de)，此類測(ce)序(xu)研究還(huan)要依靠具有高通量測(ce)序(xu)能(neng)力的(de)NGS。雖然(ran)Sanger測(ce)序(xu)具有高度的(de)分析準(zhun)確性，但(dan)其(qi)準(zhun)確性還取(qu)決于測(ce)序(xu)儀(yi)器以(yi)及測(ce)序(xu)條件的(de)設(she)定。另外，Sanger測(ce)序(xu)不能檢測(ce)出大片(pian)段缺失或拷貝數變異(yi)等(deng)基因(yin)突變的類型，因(yin)此對于一些與此相(xiang)關的遺傳性疾病還不能做出基因(yin)學診斷。

1.2連鎖分析采用的是間接測序法

在NGS出(chu)(chu)現(xian)之(zhi)前(qian)，國際通(tong)用的(de)疾病基(ji)因(yin)(yin)定位克隆(long)策(ce)略是建立在大規模全基(ji)因(yin)(yin)掃描(miao)和(he)連鎖分析基(ji)礎上的(de)位置(zhi)候選基(ji)因(yin)(yin)克隆(long)。人類的(de)染(ran)色體(ti)(ti)成對(dui)出(chu)(chu)現(xian)，一條來自(zi)父親，一條來自(zi)母親，每一對(dui)染(ran)色體(ti)(ti)在同樣的(de)位置(zhi)上擁(yong)有相同的(de)基(ji)因(yin)(yin)，但是其序(xu)列并不完全相同，被稱為(wei)父系和(he)母系等(deng)位基(ji)因(yin)(yin)。

遺傳標記是指在(zai)人群中(zhong)表現出(chu)多態(tai)現象(xiang)的DNA序(xu)列(lie)(lie)，可(ke)追(zhui)蹤染色(se)(se)體、染色(se)(se)體某一(yi)節段或某個(ge)基因座在(zai)(zai)家系中傳遞的任何一(yi)種遺傳特性(xing)。它存在(zai)(zai)于每一(yi)個(ge)人，但大小和序(xu)列(lie)(lie)有差別(bie)，具有可(ke)遺傳性(xing)和可(ke)識別(bie)性(xing)。目前采用(yong)第(di)二代遺傳標(biao)記，即重(zhong)復序(xu)列(lie)(lie)多態性(xing)，特別(bie)是短(duan)串聯重(zhong)復序(xu)列(lie)(lie)，又稱微衛星(xing)標(biao)記。

連鎖分析是以連鎖這種遺傳(chuan)(chuan)現(xian)象為(wei)基礎，研究致病基因(yin)與遺傳(chuan)(chuan)性(xing)標記(ji)之間關(guan)(guan)系的方法。如果控(kong)制某(mou)一表型(xing)性(xing)狀(zhuang)的基因(yin)附近存在(zai)遺傳(chuan)(chuan)標記(ji)，那(nei)么(me)利(li)用(yong)某(mou)個(ge)遺傳(chuan)(chuan)標記(ji)與某(mou)個(ge)擬定位的基因(yin)之間是否存在(zai)連鎖關(guan)(guan)系，以及連鎖的緊密(mi)程度就能將該基因(yin)定位到染色(se)體某(mou)一位置上。1986年Morton等提出優勢(shi)對數記分法(log odds score method，LOD)，主要檢測兩基因以某一重組率連鎖(suo)時的似然性。LOD值為正，支(zhi)持連鎖；LOD值(zhi)為負(fu)，則否定連鎖。通過計算家(jia)系中的(de)微衛星標(biao)記與致病位點之(zhi)間的(de)LOD值(zhi)，可以初步估算二者(zhe)間的(de)(de)遺傳距離及連(lian)鎖(suo)程度，從而確(que)定該(gai)基(ji)因(yin)(yin)在染(ran)色(se)體(ti)上(shang)的(de)(de)粗略位置。然后利用該(gai)區域的(de)(de)染(ran)色(se)體(ti)基(ji)因(yin)(yin)圖譜，分析定位區域內所有基(ji)因(yin)(yin)的(de)(de)功(gong)能(neng)與表達，選擇(ze)合適的(de)(de)候選基(ji)因(yin)(yin)進(jin)行突變檢測，最終將致病基(ji)因(yin)(yin)定位或克(ke)隆。

然而，采用連(lian)鎖分析進行基(ji)因檢測存(cun)在很大(da)的局限(xian)性(xing)。不但所需遺傳(chuan)樣本量較大(da)，一(yi)般(ban)要求提供三代及以上遺傳(chuan)家系患者血(xue)樣，而且數據量大(da)、處(chu)理復雜、產出(chu)速度(du)較慢、定位不夠精確(一(yi)般只能定位在染色體某一(yi)區間)，這就使(shi)得研究(jiu)工作繁重和定位(wei)基(ji)因的(de)時間周(zhou)期(qi)特別長。目前，連鎖(suo)分析采用的(de)單核苷(gan)酸多(duo)肽(tai)性(xing)(xing)和短(duan)串聯重復序列(lie)還(huan)在(zai)使(shi)用，但經(jing)典的(de)間接測序方法(fa)，如單鏈構(gou)象多(duo)肽(tai)性(xing)(xing)、變性(xing)(xing)梯(ti)度(du)凝膠電泳和異源(yuan)雙鏈分析在(zai)美國(guo)已被(bei)淘汰，而在(zai)發展(zhan)中國(guo)家作為研究(jiu)手(shou)段還(huan)在(zai)有限(xian)使(shi)用。

2、新一代測序(NGS)

主要包括全基(ji)因(yin)組(zu)重測序(whole-genomesequencing，WGS)、全(quan)外顯子組測序(whole-exomesequencing，WES)和目(mu)標區域測序(Targeted regionssequencing，TRS)，它們同屬于新(xin)一代(dai)測序技(ji)術(shu)。總(zong)體而(er)言，NGS技術(shu)具有(you)通(tong)量(liang)大、時(shi)間短、精確(que)度(du)高(gao)和信息量(liang)豐富(fu)等(deng)(deng)優點(dian)，使得遺(yi)傳學(xue)者可以在(zai)短時(shi)間內(nei)對感(gan)興趣的(de)基因進行精確(que)定位。但這些不(bu)同的(de)測(ce)序技術(shu)在(zai)測(ce)序范圍、數(shu)據(ju)分析量(liang)以及測(ce)序費用和時(shi)間等(deng)(deng)方面又有(you)很大差別(bie)，如果(guo)選擇(ze)適合的(de)方法，對于臨床診斷和科(ke)學(xue)研究將起到事半功倍的(de)作用。

2.1目標區域測序目前常用的是基因芯片技術

其測序原理(li)是基于DNA雜交原(yuan)理，利用目標基因(yin)組(zu)區(qu)域定制的(de)探針與基因(yin)組(zu)DNA進行芯片(pian)雜(za)交(jiao)或溶液雜(za)交(jiao)，將目標基因區域DNA富(fu)集，再通過NGS技(ji)術(shu)進(jin)行測(ce)(ce)序(xu)(xu)。其測(ce)(ce)序(xu)(xu)過程是(shi)通過把數以萬計的cDNA或(huo)寡聚核(he)苷酸(suan)置于芯片(pian)上制成列陣，將(jiang)芯片(pian)上固定(ding)好(hao)的(de)(de)已(yi)知序列的(de)(de)核(he)苷酸(suan)探針與溶液中(zhong)含有熒(ying)光標記的(de)(de)相應核(he)酸(suan)序列進行(xing)互補配對，根據測序儀所顯示強(qiang)熒(ying)光的(de)(de)位置和強(qiang)度，獲取每組(zu)點陣列信息，再利(li)用生物信息學(xue)算法確定(ding)目的(de)(de)靶(ba)核(he)苷酸(suan)的(de)(de)序列組(zu)成。測序所選定(ding)的(de)(de)目標區(qu)域可以(yi)是(shi)連(lian)續的(de)(de)DNA序(xu)列，也可以是(shi)分布在(zai)同(tong)一(yi)個染色體不同(tong)區域或不同(tong)染色體上的(de)片段。目標區域測(ce)序(xu)技術，對(dui)于以往通過(guo)連鎖分析將(jiang)基因(yin)突變(bian)鎖定(ding)在(zai)染色體某一(yi)片段區域內，但無法找出突變(bian)是(shi)一(yi)個非常(chang)好的(de)進一(yi)步檢測(ce)手段。2010年，Nicholas等使用基(ji)(ji)因分(fen)型(xing)芯片聯合連(lian)鎖分(fen)析技(ji)術，成功發(fa)現頭小畸形的新基(ji)(ji)因WDR62，文章發表在《NatGenet》雜志。類似的研究(jiu)在(zai)家族(zu)性胰腺癌中確定8個(ge)候選變異(yi)位點(dian)和在家族性(xing)滲出性(xing)玻璃體視網膜病變發現(xian)易感基因(yin)TSPAN12。

基(ji)因(yin)芯片測(ce)(ce)序(xu)技術可(ke)以將(jiang)經過連鎖分析鎖定了目標(biao)范圍或經過全基(ji)因(yin)組篩選的特定基(ji)因(yin)或區(qu)域進行更深一層的研究，是解決(jue)連鎖分析無法發現(xian)致病基(ji)因(yin)的有效手(shou)段。基(ji)因(yin)芯片技術對于(yu)已知(zhi)基(ji)因(yin)突變(bian)的篩查具有明顯優(you)勢(shi)，可(ke)以快速、全面(mian)地檢測(ce)(ce)出(chu)目標(biao)基(ji)因(yin)突變(bian)。同時(shi)(shi)，由于(yu)目標(biao)區(qu)域受到了限(xian)制，測(ce)(ce)序(xu)范圍大幅度(du)減少(shao)，測(ce)(ce)序(xu)時(shi)(shi)間和(he)費用相應(ying)降低。但基(ji)因(yin)芯片檢測(ce)(ce)所需要(yao)的DNA的量要(yao)大，由于已提取的DNA存(cun)在降解的(de)風險，用(yong)于基(ji)因芯片研究(jiu)的(de)血(xue)標本最(zui)好是冰(bing)凍的(de)全血(xue)，這樣可以使用(yong)于檢測(ce)DNA的量(liang)有充分保(bao)證(zheng)。

2.2全外顯子組測序(WES)

外(wai)顯子組是單(dan)個個體(ti)的基因組DNA上所有蛋白質(zhi)編碼(ma)序列的總合。人(ren)類外顯(xian)子組序列約占人(ren)類全部基因組序列的1%，但大約(yue)包含85%的致病突(tu)變。WES是利用序列(lie)捕獲技(ji)術將(jiang)全(quan)外(wai)顯子區域(yu)DNA捕(bu)捉并富集后進行高通量測序的基(ji)因(yin)分析方(fang)法。采(cai)用(yong)的技術平臺主要是羅氏公(gong)司的SeqCap EZ全外(wai)顯子(zi)捕獲(huo)系統，Illumina公司的(de)Solexa技術(shu)和Agilent公司的SureSelect外顯子靶向(xiang)序列富(fu)集系(xi)統(tong)。其捕獲(huo)的目標區在(zai)34~62 M之(zhi)間，不僅包(bao)括(kuo)編(bian)碼區同時也加入(ru)了部分(fen)非編(bian)碼區。NGS的(de)測(ce)序過(guo)程主(zhu)要包括(kuo)DNA測序(xu)文庫的制(zhi)備、錨定橋接(jie)、PCR擴(kuo)增、單堿(jian)基(ji)延伸測(ce)(ce)序(xu)和(he)數據分析。研究者根據測(ce)(ce)序(xu)儀捕獲(huo)到(dao)在(zai)測(ce)(ce)序(xu)過程中摻入有不(bu)同熒光標記堿(jian)基(ji)片段，經(jing)計算(suan)機將熒光信(xin)號轉化成不(bu)同顏(yan)色的測(ce)(ce)序(xu)峰圖和(he)堿(jian)基(ji)序(xu)列。基(ji)因測(ce)(ce)序(xu)結果與NCBI的SNP數(shu)據庫、千(qian)人基(ji)因(yin)組數(shu)據庫等國際權(quan)威數(shu)據庫比(bi)對，最(zui)終確(que)定是否(fou)為突變基(ji)因(yin)。

自NGS技術問世以來，利用WES在臨(lin)床疾(ji)病(bing)致病(bing)基(ji)因(yin)(yin)的鑒定研(yan)究(jiu)中(zhong)(zhong)(zhong)取得前所(suo)未(wei)有(you)的成果。這些成果不(bu)僅集中(zhong)(zhong)(zhong)在單基(ji)因(yin)(yin)遺傳(chuan)疾(ji)病(bing)，還在多基(ji)因(yin)(yin)影響的復雜疾(ji)病(bing)中(zhong)(zhong)(zhong)獲得大量相(xiang)關基(ji)因(yin)(yin)的發(fa)現。在單基(ji)因(yin)(yin)遺傳(chuan)性疾(ji)病(bing)中(zhong)(zhong)(zhong)，如視網膜色素變性、終端骨發(fa)育不(bu)良等發(fa)現新基(ji)因(yin)(yin)或已知基(ji)因(yin)(yin)新突變。在一些罕見(jian)的疾(ji)病(bing)中(zhong)(zhong)(zhong)，如Kabuki綜合征(zheng)、家(jia)族性混合型低(di)脂血(xue)(xue)癥(zheng)和脊(ji)髓小(xiao)(xiao)腦共濟(ji)失調(diao)癥(zheng)等(deng)(deng)疾病中(zhong)發現新的致病基(ji)因。同時，在小(xiao)(xiao)細胞(bao)肺癌、慢性淋巴(ba)細胞(bao)性白血(xue)(xue)病等(deng)(deng)腫瘤研究(jiu)和諸(zhu)如肥胖癥(zheng)、腦皮質(zhi)發育不(bu)良等(deng)(deng)復雜疾病的研究(jiu)中(zhong)也取得豐碩成果。

WES技(ji)術在篩(shai)查范(fan)圍和檢出率等(deng)方(fang)面較其他(ta)測序(xu)技(ji)術具(ju)有明顯的優勢。例如，對于(yu)采(cai)用Sanger測(ce)序和基(ji)因(yin)(yin)芯片測(ce)序不能篩查出基(ji)因(yin)(yin)的樣本，可以采用WES來進一步基(ji)因篩查鑒定。應用WES技(ji)術能夠(gou)獲得(de)較傳統Sanger等方(fang)法對編碼區測序更(geng)深的(de)覆蓋(gai)度(du)和更(geng)準確的(de)數(shu)據。由于(yu)信息量的(de)大幅度(du)增加(jia)，WES可以獲得更多(duo)個體(ti)的編碼區(qu)信(xin)息，因此成為檢測致病基因和易感基因位(wei)點的有(you)效手(shou)段。與連鎖(suo)分析定位(wei)方法比(bi)較，WES對(dui)家系(xi)的(de)要求并不十分(fen)嚴格，在單基因遺(yi)傳病(bing)同一家系(xi)中有2~3個患者和1個正常(chang)人即可(ke)進(jin)行致(zhi)病(bing)基(ji)因的(de)鑒定研(yan)究，而不(bu)需要(yao)連續三(san)代的(de)遺傳家系(xi)。由于(yu)不(bu)需要(yao)嚴格的(de)三(san)代以上的(de)遺傳家系(xi)，WES使以前不能(neng)進行(xing)研(yan)究(jiu)的家系成為可能(neng)。不僅對(dui)于(yu)單基(ji)因遺傳(chuan)病(bing)(bing)是一個很好的研(yan)究(jiu)手段，對(dui)于(yu)許(xu)多常見病(bing)(bing)，如腫瘤(liu)、糖尿(niao)病(bing)(bing)等疾(ji)病(bing)(bing)也可進行(xing)大規模比較研(yan)究(jiu)。

2.3全基因組重測序(WGS)

WGS是對(dui)已(yi)知基(ji)因組(zu)(zu)(zu)(zu)序(xu)列(lie)(lie)的物種進(jin)行(xing)不(bu)同個體(ti)的全基(ji)因組(zu)(zu)(zu)(zu)的測序(xu)，經過(guo)數據分析后(hou)對(dui)序(xu)列(lie)(lie)進(jin)行(xing)拼(pin)接、組(zu)(zu)(zu)(zu)裝并獲得(de)基(ji)因組(zu)(zu)(zu)(zu)圖譜，或是對(dui)不(bu)同組(zu)(zu)(zu)(zu)織進(jin)行(xing)測序(xu)并分析體(ti)細胞突變的一種研究(jiu)方法(fa)。盡管(guan)WES可以快速全面地(di)(di)找(zhao)出個體基因組上的(de)所有(you)突變，從而找(zhao)到個體間的(de)差異，但對(dui)(dui)于外(wai)顯子以外(wai)的(de)區(qu)域則不能有(you)效(xiao)地(di)(di)進行基因檢測。對(dui)(dui)于此(ci)種情況，目前還要借助WGS進(jin)行全基因組(zu)檢測(ce)。但由于人類基因組(zu)過于龐大，一(yi)次單端全基因組(zu)測(ce)序(xu)很難(nan)達(da)到所需要的測(ce)序(xu)深度。因此，需要重復測(ce)序(xu)或雙端測(ce)序(xu)，由此帶來測(ce)序(xu)成(cheng)本的大幅(fu)度提高(gao)(gao)和由于不(bu)能達(da)到足夠的測(ce)序(xu)深度所導致(zhi)的結(jie)果準確性的降低。而對(dui)于臨(lin)床疾病診斷和普通(tong)科研工作，其高(gao)(gao)昂的檢測(ce)費用也(ye)是(shi)難(nan)以(yi)承受的。盡(jin)管如此，對(dui)于部(bu)分(fen)臨(lin)床研究和WES不(bu)能解決的科研課題(ti)還需要借(jie)助WGS進(jin)行更加全面(mian)的(de)基因檢測(ce)。

3、展望

NGS的(de)(de)出(chu)現為(wei)新興的(de)(de)基(ji)因(yin)組(zu)技術增添了無限的(de)(de)活力和(he)想象空(kong)間。特別是基(ji)因(yin)芯片的(de)(de)問世和(he)已在臨床上應用(yong)于大樣本(ben)的(de)(de)疾病篩(shai)查和(he)基(ji)因(yin)診斷中所展(zhan)(zhan)現出(chu)的(de)(de)活力，以及其商業化發(fa)展(zhan)(zhan)的(de)(de)模式都令人鼓舞。在眼科(ke)是單基(ji)因(yin)病最常(chang)見的(de)(de)學科(ke)，利用(yong)芯片技術進行Laber病的篩(shai)(shai)查已使很(hen)多病因(yin)不清楚的視(shi)神經萎縮得到(dao)明確診斷。而原發性開(kai)角型青光眼(yan)是(shi)眼(yan)科(ke)最(zui)具隱蔽性和危(wei)險性的致(zhi)盲性眼(yan)病，其(qi)致(zhi)病基因(yin)或(huo)突變的鑒定研(yan)究(jiu)對疾病篩(shai)(shai)查將有著(zhu)非(fei)常(chang)重(zhong)要的臨床價值(zhi)和巨(ju)大的商業價值(zhi)。在新生(sheng)兒糖(tang)尿病的篩(shai)(shai)查中采(cai)用基因(yin)芯片(pian)技(ji)術可以更加快速、全面經濟(ji)，避免第一代(dai)測(ce)序過于繁(fan)瑣和漏檢。

基(ji)因芯片技(ji)術在產前(qian)診(zhen)斷(duan)中更加具有(you)發展前(qian)景。只要(yao)對孕(yun)婦進行DNA血液檢(jian)查(cha)即(ji)可(ke)進行遺(yi)傳(chuan)疾(ji)病的(de)(de)篩查(cha)，避(bi)免以(yi)往通過羊(yang)膜穿刺抽取羊(yang)水(shui)進行有創檢(jian)查(cha)的(de)(de)局(ju)限(xian)性和危險性。目前(qian)，基(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)檢(jian)測(ce)技(ji)術(shu)水(shui)平的(de)(de)提(ti)(ti)升和檢(jian)測(ce)費用的(de)(de)不斷降低，發(fa)展(zhan)(zhan)大規模個(ge)體(ti)化基(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)檢(jian)測(ce)在不久的(de)(de)將(jiang)來成(cheng)為可(ke)能(neng)。同時，藥物易(yi)感(gan)性基(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)和疾(ji)病發(fa)生的(de)(de)易(yi)感(gan)基(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)的(de)(de)檢(jian)測(ce)的(de)(de)深入開(kai)展(zhan)(zhan)，個(ge)體(ti)化醫療將(jiang)在基(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)檢(jian)測(ce)的(de)(de)基(ji)(ji)(ji)礎上得以(yi)實現。有理由相信，隨(sui)著(zhu)人們生活水(shui)平的(de)(de)不斷提(ti)(ti)高和健(jian)康意識不斷增強，基(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)檢(jian)測(ce)在未來醫學發(fa)展(zhan)(zhan)中(zhong)應用前(qian)景將(jiang)十分可(ke)觀(guan)。