【基因檢測方法比較】基因檢測方法有哪些 基因檢測技術原理

1、第一代測序

1.1 Sanger測序采用的是直接測序法

1977年，Frederick Sanger等發明了雙脫氧鏈末端終止法，這一技術隨后成為最為常用的基因測序技術。2001年(nian)，Allan Maxam和Walter Gibert發明(ming)了Sanger測序法，并在(zai)此(ci)后的10年里成(cheng)為基(ji)因檢測的金標準。其基(ji)本原理即(ji)雙脫(tuo)氧核苷三磷酸(dideoxyribonucleoside triphosphate，ddNTP)缺乏(fa)PCR延伸所需的3'-OH，因此(ci)每當DNA鏈加入分(fen)子ddNTP，延伸便終(zhong)止(zhi)。每一次DNA測序是由4個獨(du)立(li)的(de)反應(ying)組成，將模板(ban)、引物和4種含有不同的放(fang)射性(xing)同位素標記的核苷酸的ddNTP分別(bie)與(yu)DNA聚合(he)酶混合(he)形成長短不一的(de)片段，大量起(qi)始點相同(tong)、終(zhong)止點不同(tong)的(de)DNA片段存在于反應體系中，具有單個堿基(ji)差(cha)別的(de)DNA序列可以被聚丙烯酰胺變性(xing)凝膠電(dian)泳(yong)分(fen)離出來，得到放射性(xing)同位(wei)素(su)自顯影(ying)條帶。依據電(dian)泳(yong)條帶讀(du)取DNA雙鏈(lian)的(de)堿基序(xu)列。

人類基因組(zu)的(de)測序(xu)正是(shi)基于(yu)該技術(shu)完成(cheng)的(de)。Sanger測序這(zhe)種直接測序方法具有(you)高度(du)的準(zhun)確性(xing)和簡單、快捷(jie)等特點(dian)。目前，依然對于一些(xie)臨床上小(xiao)樣本(ben)遺傳(chuan)疾病(bing)基因的鑒定具有(you)很(hen)高的實用價值。例如，臨床上采(cai)用Sanger直(zhi)接測序FGFR 2基(ji)因(yin)(yin)證實單基(ji)因(yin)(yin)Apert綜合征和直接(jie)測序(xu)TCOF1基因可以檢出多達90%的與(yu)Treacher Collins綜(zong)合(he)征相關的(de)突(tu)變。值(zhi)得注意的(de)是，Sanger測序是(shi)針對(dui)已知(zhi)致病基因的突變位點設計引物(wu)，進行(xing)PCR直接擴(kuo)增(zeng)測序(xu)。單(dan)個突變點(dian)的(de)擴(kuo)增(zeng)包括(kuo)該位點(dian)在(zai)內的(de)外顯子片段即可，不必將該點(dian)所(suo)在(zai)基因(yin)的(de)全部外顯子都擴(kuo)增(zeng)。

因此(ci)，應明確(que)定(ding)位要擴增的位點(dian)所在(zai)的基因外顯子和該(gai)點(dian)的具(ju)體(ti)位置，設(she)計包括該(gai)點(dian)在(zai)內(nei)的上下游150~200 bp的外顯子片段引物。此(ci)外，盡管有NGS的出現(xian)，但Sanger測序對于(yu)有致病(bing)基因位(wei)點明確并且數量有限(xian)的(de)單基因遺傳(chuan)疾病(bing)的(de)致病(bing)基因的(de)檢(jian)測是(shi)非常(chang)經濟和高效的(de)。到目前為止，Sanger測(ce)序(xu)仍然(ran)是作為基因檢(jian)測(ce)的金標準，也是NGS基因檢測后進行家系內(nei)和正(zheng)常對照組驗證的(de)主要手(shou)段。

值(zhi)得注意(yi)的是，Sanger測序目的(de)是(shi)尋找與疾病有關(guan)的(de)特(te)定的(de)基因突變(bian)。對于(yu)沒(mei)有明(ming)確候選(xuan)(xuan)基因或候選(xuan)(xuan)基因數(shu)量(liang)較多的(de)大(da)樣本病例篩查(cha)是(shi)難以完成的(de)，此(ci)類(lei)測序研究還要(yao)依靠具(ju)有高通量(liang)測序能力的(de)NGS。雖然(ran)Sanger測(ce)序具有高度的(de)分(fen)析準確性(xing)，但其準確性(xing)還取決于測(ce)序儀(yi)器以及測(ce)序條件的(de)設定(ding)。另外，Sanger測序不能檢測出大片段缺(que)失或拷(kao)貝數變(bian)異等基因(yin)突(tu)變(bian)的類(lei)型，因(yin)此(ci)對于(yu)一些與此(ci)相關(guan)的遺傳(chuan)性疾病(bing)還不能做出基因(yin)學診(zhen)斷。

1.2連鎖分析采用的是間接測序法

在NGS出現(xian)之前，國際通用(yong)的(de)(de)疾病基因(yin)(yin)定位克隆策略是建(jian)立在大規模全基因(yin)(yin)掃描和(he)連(lian)鎖分(fen)析基礎上(shang)(shang)的(de)(de)位置(zhi)候選基因(yin)(yin)克隆。人(ren)類的(de)(de)染色體(ti)成對出現(xian)，一(yi)(yi)條(tiao)(tiao)來自父親(qin)，一(yi)(yi)條(tiao)(tiao)來自母親(qin)，每一(yi)(yi)對染色體(ti)在同樣的(de)(de)位置(zhi)上(shang)(shang)擁(yong)有(you)相(xiang)同的(de)(de)基因(yin)(yin)，但是其序列并不完全相(xiang)同，被稱為父系和(he)母系等位基因(yin)(yin)。

遺傳標記是指在人群中表(biao)現(xian)出多態(tai)現(xian)象的DNA序列(lie)，可追(zhui)蹤染色體、染色體某一節段(duan)或某個基因座在家系中傳(chuan)遞的任何一種遺傳(chuan)特(te)性。它存在于每一個人(ren)，但大(da)小(xiao)和序列(lie)有差別，具有可遺傳(chuan)性和可識(shi)別性。目前(qian)采用第二代遺傳(chuan)標記，即重復(fu)序列(lie)多態性，特(te)別是短串聯重復(fu)序列(lie)，又稱微衛星標記。

連鎖(suo)(suo)分析是以連鎖(suo)(suo)這種遺(yi)(yi)傳(chuan)(chuan)現象(xiang)為(wei)基礎，研究致病基因與遺(yi)(yi)傳(chuan)(chuan)性標(biao)記(ji)之間(jian)關系的(de)方法(fa)。如果控(kong)制某(mou)(mou)一表型性狀的(de)基因附(fu)近存(cun)(cun)在遺(yi)(yi)傳(chuan)(chuan)標(biao)記(ji)，那么(me)利(li)用(yong)某(mou)(mou)個(ge)遺(yi)(yi)傳(chuan)(chuan)標(biao)記(ji)與某(mou)(mou)個(ge)擬定位(wei)(wei)的(de)基因之間(jian)是否(fou)存(cun)(cun)在連鎖(suo)(suo)關系，以及連鎖(suo)(suo)的(de)緊密程(cheng)度就能(neng)將該基因定位(wei)(wei)到染色(se)體(ti)某(mou)(mou)一位(wei)(wei)置上。1986年Morton等(deng)提(ti)出優勢對(dui)數(shu)記分法(log odds score method，LOD)，主(zhu)要檢測兩(liang)基因(yin)以某一重(zhong)組率(lv)連鎖時的似然性(xing)。LOD值為正(zheng)，支持連(lian)鎖(suo)；LOD值(zhi)為負，則(ze)否定連(lian)鎖。通過(guo)計算(suan)家系中的微衛星標(biao)記與致病位(wei)點之間的LOD值，可以初步估(gu)算(suan)二者間的遺傳(chuan)距離(li)及連鎖程度，從而確定該基(ji)(ji)(ji)因(yin)在(zai)染色(se)體上的粗略位(wei)置(zhi)。然(ran)后(hou)利用該區域的染色(se)體基(ji)(ji)(ji)因(yin)圖譜，分析定位(wei)區域內(nei)所有基(ji)(ji)(ji)因(yin)的功能與表達(da)，選擇合適的候選基(ji)(ji)(ji)因(yin)進行突變檢測，最終(zhong)將致病基(ji)(ji)(ji)因(yin)定位(wei)或克隆。

然而，采用連鎖分析進行基因檢(jian)測(ce)存在很大的局(ju)限性。不但所(suo)需遺(yi)傳樣本量較大，一(yi)般(ban)要求提供三代及以上(shang)遺(yi)傳家系患者血樣，而且數(shu)據量大、處理復雜、產出速度(du)較慢、定位不夠(gou)精確(que)(一般只(zhi)能定位在染色體(ti)某一區間)，這(zhe)就使得研究工作繁(fan)重(zhong)和定位基因的(de)時間周期特別長。目前，連鎖分(fen)析采用(yong)的(de)單(dan)(dan)核苷酸多肽(tai)性和短(duan)串聯重(zhong)復序(xu)列還(huan)在使用(yong)，但(dan)經典(dian)的(de)間接測序(xu)方法，如單(dan)(dan)鏈構(gou)象多肽(tai)性、變(bian)性梯度凝膠電泳和異源雙鏈分(fen)析在美國已被淘汰，而在發展中國家(jia)作為研究手(shou)段還(huan)在有限使用(yong)。

2、新一代測序(NGS)

主(zhu)要包括全基因組(zu)重測序(whole-genomesequencing，WGS)、全外顯子組(zu)測序(whole-exomesequencing，WES)和目(mu)標區域測序(Targeted regionssequencing，TRS)，它(ta)們同屬于(yu)新一代測序技術。總體而言，NGS技(ji)術具有(you)通量(liang)大(da)、時間(jian)短(duan)、精確(que)度高和(he)信息量(liang)豐富等優點，使得遺傳學(xue)者可以在(zai)短(duan)時間(jian)內對感興趣(qu)的(de)基因進行精確(que)定位。但這些不同的(de)測序(xu)技(ji)術在(zai)測序(xu)范(fan)圍、數據分析量(liang)以及測序(xu)費用(yong)和(he)時間(jian)等方面又有(you)很大(da)差(cha)別，如果選擇適合的(de)方法，對于臨床診斷和(he)科(ke)學(xue)研究(jiu)將起到事半功倍的(de)作(zuo)用(yong)。

2.1目標區域測序目前常用的是基因芯片技術

其測(ce)序原理是基于DNA雜交原(yuan)理，利用目標基因(yin)組(zu)區域定(ding)制的(de)探針與基因(yin)組(zu)DNA進行芯片雜(za)(za)交或(huo)溶液雜(za)(za)交，將目標基(ji)因區域DNA富集(ji)，再通過NGS技術進行(xing)測序。其測序過程是通過把數以萬計的(de)cDNA或(huo)寡聚(ju)核(he)苷酸(suan)置于芯片上(shang)制成(cheng)列陣，將芯片上(shang)固(gu)定(ding)好的(de)已知序列的(de)核(he)苷酸(suan)探針與溶液中含有熒光標(biao)記(ji)的(de)相(xiang)應核(he)酸(suan)序列進行(xing)互補配對，根據測序儀所(suo)顯示(shi)強熒光的(de)位置和強度，獲取每組點(dian)陣列信息，再利(li)用生物信息學算法確定(ding)目(mu)的(de)靶核(he)苷酸(suan)的(de)序列組成(cheng)。測序所(suo)選定(ding)的(de)目(mu)標(biao)區域可以是連續的(de)DNA序(xu)列，也可以(yi)是(shi)分布在(zai)同(tong)一個染色(se)體(ti)不(bu)同(tong)區域(yu)或不(bu)同(tong)染色(se)體(ti)上的片(pian)段。目(mu)標區域(yu)測(ce)序(xu)技術，對于以(yi)往通過連鎖(suo)分析將基因突變(bian)鎖(suo)定(ding)在(zai)染色(se)體(ti)某一片(pian)段區域(yu)內(nei)，但無法找(zhao)出突變(bian)是(shi)一個非常好的進一步檢測(ce)手段。2010年，Nicholas等(deng)使用(yong)基(ji)因(yin)(yin)分(fen)型芯片聯合連鎖分(fen)析技術，成功發現頭小畸形的(de)新基(ji)因(yin)(yin)WDR62，文章(zhang)發表在《NatGenet》雜志。類(lei)似的研究在家族性胰腺癌中確定8個候選變異位點和在(zai)家族性滲出性玻璃體(ti)視網膜(mo)病變發(fa)現(xian)易感基因(yin)TSPAN12。

基(ji)(ji)因(yin)芯(xin)(xin)片測序技(ji)術(shu)可以將經過連鎖(suo)分(fen)析(xi)鎖(suo)定(ding)了目標(biao)(biao)范(fan)圍或經過全(quan)基(ji)(ji)因(yin)組篩(shai)選的特定(ding)基(ji)(ji)因(yin)或區域進行更深一層的研究，是解決連鎖(suo)分(fen)析(xi)無法發現致(zhi)病基(ji)(ji)因(yin)的有效手段。基(ji)(ji)因(yin)芯(xin)(xin)片技(ji)術(shu)對于已知基(ji)(ji)因(yin)突變(bian)(bian)的篩(shai)查具(ju)有明顯優勢，可以快速、全(quan)面地檢測出目標(biao)(biao)基(ji)(ji)因(yin)突變(bian)(bian)。同時，由于目標(biao)(biao)區域受到(dao)了限(xian)制，測序范(fan)圍大幅(fu)度減少(shao)，測序時間(jian)和費用相(xiang)應降低。但基(ji)(ji)因(yin)芯(xin)(xin)片檢測所需(xu)要(yao)的DNA的量要大，由于已提取(qu)的DNA存在降解的(de)風險，用于(yu)基因芯片研究(jiu)的(de)血(xue)標本最好是冰(bing)凍的(de)全(quan)血(xue)，這樣可(ke)以(yi)使用于(yu)檢測DNA的量(liang)有充分保證。

2.2全外顯子組測序(WES)

外顯(xian)子組是單(dan)個(ge)個(ge)體(ti)的(de)基因組DNA上所(suo)有蛋白質編(bian)碼(ma)序列的(de)(de)總合。人(ren)類外顯(xian)子組(zu)(zu)序列約占人(ren)類全(quan)部基因組(zu)(zu)序列的(de)(de)1%，但大約包含85%的(de)致病突變。WES是(shi)利用序列捕獲技(ji)術將(jiang)全(quan)外顯子區域(yu)DNA捕捉(zhuo)并富集后進行高通(tong)量測(ce)序(xu)的基因分(fen)析(xi)方法。采用的技(ji)術平臺主要(yao)是(shi)羅氏(shi)公司的SeqCap EZ全(quan)外顯子(zi)捕獲系統，Illumina公司的Solexa技術和Agilent公司的SureSelect外顯子(zi)靶向序列富集系(xi)統。其捕獲的目標區在(zai)34~62 M之(zhi)間(jian)，不僅(jin)包括編(bian)碼(ma)區同時也(ye)加入了部(bu)分(fen)非編(bian)碼(ma)區。NGS的(de)測序過程主要(yao)包括DNA測序文庫的制備、錨定橋(qiao)接、PCR擴增、單堿基延伸(shen)測(ce)序(xu)和數據(ju)分(fen)析。研究者根據(ju)測(ce)序(xu)儀捕獲到在測(ce)序(xu)過程(cheng)中摻(chan)入有不同(tong)熒(ying)光標記(ji)堿基片段，經計算機將熒(ying)光信號轉化成(cheng)不同(tong)顏色的測(ce)序(xu)峰(feng)圖和堿基序(xu)列(lie)。基因測(ce)序(xu)結(jie)果與NCBI的SNP數據(ju)庫(ku)、千人(ren)基因組(zu)數據(ju)庫(ku)等國際權(quan)威(wei)數據(ju)庫(ku)比(bi)對，最終(zhong)確定是否為突(tu)變(bian)基因。

自NGS技術(shu)問世以來，利用WES在(zai)臨床疾病(bing)(bing)致病(bing)(bing)基(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)的(de)鑒定研究中(zhong)取得前所未有的(de)成果。這些(xie)成果不僅(jin)集中(zhong)在(zai)單基(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)遺(yi)傳疾病(bing)(bing)，還在(zai)多基(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)影(ying)響的(de)復(fu)雜(za)疾病(bing)(bing)中(zhong)獲(huo)得大量相關基(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)的(de)發現(xian)。在(zai)單基(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)遺(yi)傳性疾病(bing)(bing)中(zhong)，如視網膜色素(su)變性、終端骨(gu)發育不良等發現(xian)新基(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)或已知基(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)新突變。在(zai)一些(xie)罕見的(de)疾病(bing)(bing)中(zhong)，如Kabuki綜合征(zheng)、家族(zu)性(xing)(xing)混(hun)合型低脂血癥和脊髓小腦(nao)共(gong)濟(ji)失調癥等疾病(bing)中發(fa)現(xian)新(xin)的(de)致(zhi)病(bing)基因。同時(shi)，在小細(xi)(xi)胞(bao)肺癌、慢(man)性(xing)(xing)淋巴細(xi)(xi)胞(bao)性(xing)(xing)白(bai)血病(bing)等腫瘤研(yan)究(jiu)和諸如肥(fei)胖癥、腦(nao)皮質發(fa)育不良等復雜疾病(bing)的(de)研(yan)究(jiu)中也取得豐(feng)碩成果。

WES技(ji)術在篩查范圍和檢(jian)出率等方面較其(qi)他(ta)測序技(ji)術具有明顯的優勢(shi)。例(li)如，對于采用Sanger測序和基(ji)因芯片測序不(bu)能篩查出基(ji)因的樣本(ben)，可以采用WES來進(jin)一步(bu)基因篩查鑒定。應用(yong)WES技(ji)術能夠獲(huo)得較傳統Sanger等方法對編碼區測序更深的覆蓋度(du)和更準確(que)的數據(ju)。由于信息量的大幅(fu)度(du)增加，WES可(ke)以獲得更(geng)多個體的編(bian)碼區信息，因(yin)此(ci)成為檢測致病基(ji)因(yin)和易感基(ji)因(yin)位點的有效手段。與連(lian)鎖分析定位方法比較，WES對(dui)家系的要求(qiu)并(bing)不(bu)十分嚴格，在單基因(yin)遺(yi)傳病同一家系中有2~3個(ge)患(huan)者(zhe)和1個正常人即可(ke)進行致病基(ji)因的(de)鑒定研(yan)究，而不需(xu)要(yao)連續(xu)三代的(de)遺(yi)傳(chuan)家(jia)系(xi)。由于不需(xu)要(yao)嚴格的(de)三代以上(shang)的(de)遺(yi)傳(chuan)家(jia)系(xi)，WES使以(yi)前不(bu)(bu)能進(jin)行研究的家系(xi)成(cheng)為可能。不(bu)(bu)僅對(dui)于(yu)單基因遺傳病是(shi)一個很好(hao)的研究手段(duan)，對(dui)于(yu)許(xu)多(duo)常(chang)見(jian)病，如腫瘤、糖尿病等(deng)疾病也可進(jin)行大(da)規(gui)模比較研究。

2.3全基因組重測序(WGS)

WGS是對(dui)已知基因組序列(lie)的(de)物(wu)種(zhong)進行(xing)不同個體的(de)全基因組的(de)測(ce)序，經過(guo)數據(ju)分析(xi)后對(dui)序列(lie)進行(xing)拼接(jie)、組裝并(bing)獲得(de)基因組圖譜，或是對(dui)不同組織進行(xing)測(ce)序并(bing)分析(xi)體細胞(bao)突變的(de)一種(zhong)研究方法。盡管WES可(ke)以(yi)快(kuai)速全面(mian)地(di)(di)找(zhao)出個體(ti)基因(yin)組上的所有(you)突變，從(cong)而找(zhao)到個體(ti)間(jian)的差異(yi)，但對(dui)于外顯子(zi)以(yi)外的區域則不能有(you)效地(di)(di)進行基因(yin)檢測。對(dui)于此種情況，目前還(huan)要借助WGS進行全(quan)基(ji)因(yin)組檢測(ce)(ce)(ce)。但由于(yu)人類基(ji)因(yin)組過于(yu)龐大(da)，一次單端(duan)全(quan)基(ji)因(yin)組測(ce)(ce)(ce)序很難(nan)達(da)到(dao)所需(xu)要(yao)的(de)測(ce)(ce)(ce)序深(shen)度。因(yin)此，需(xu)要(yao)重復測(ce)(ce)(ce)序或雙端(duan)測(ce)(ce)(ce)序，由此帶(dai)來(lai)測(ce)(ce)(ce)序成本的(de)大(da)幅度提高(gao)和由于(yu)不能達(da)到(dao)足夠的(de)測(ce)(ce)(ce)序深(shen)度所導致(zhi)的(de)結果準確性(xing)的(de)降(jiang)低。而對于(yu)臨(lin)床(chuang)疾病診斷和普通科研(yan)工作，其高(gao)昂的(de)檢測(ce)(ce)(ce)費(fei)用也是難(nan)以(yi)承受的(de)。盡管如(ru)此，對于(yu)部分臨(lin)床(chuang)研(yan)究(jiu)和WES不能解決的科研課題還需要借助WGS進行(xing)更加全面(mian)的基因檢(jian)測。

3、展望

NGS的(de)出現為(wei)新興的(de)基(ji)因(yin)(yin)組技術增添了無限的(de)活(huo)力和想象空(kong)間。特別(bie)是(shi)基(ji)因(yin)(yin)芯(xin)片(pian)的(de)問世和已在臨床上應用于(yu)大樣本(ben)的(de)疾(ji)病篩查和基(ji)因(yin)(yin)診斷中所展現出的(de)活(huo)力，以及其(qi)商業化發(fa)展的(de)模式都令人(ren)鼓(gu)舞。在眼科是(shi)單基(ji)因(yin)(yin)病最(zui)常見(jian)的(de)學(xue)科，利(li)用芯(xin)片(pian)技術進行Laber病(bing)(bing)的篩查(cha)(cha)已使(shi)很多病(bing)(bing)因(yin)不(bu)清楚(chu)的視神經(jing)萎縮得到明(ming)確診斷。而原(yuan)發性開角型青(qing)光眼(yan)是眼(yan)科(ke)最具隱(yin)蔽性和(he)危險性的致(zhi)盲(mang)性眼(yan)病(bing)(bing)，其致(zhi)病(bing)(bing)基因(yin)或突變的鑒(jian)定研究對疾病(bing)(bing)篩查(cha)(cha)將(jiang)有著非常重要的臨床價(jia)值(zhi)和(he)巨大的商業價(jia)值(zhi)。在新生(sheng)兒(er)糖(tang)尿(niao)病(bing)(bing)的篩查(cha)(cha)中(zhong)采用(yong)基因(yin)芯片技術可以(yi)更加快(kuai)速、全面經(jing)濟，避免第(di)一代測序過于繁瑣和(he)漏(lou)檢。

基因芯片技術在產前(qian)診斷中(zhong)更加具有發展前(qian)景(jing)。只要對孕(yun)婦進行DNA血液檢查(cha)即(ji)可進行(xing)遺傳疾病的(de)(de)(de)篩查(cha)，避免以往通(tong)過羊膜穿刺抽取(qu)羊水(shui)進行(xing)有創檢查(cha)的(de)(de)(de)局限性和危險(xian)性。目前(qian)，基(ji)因(yin)檢測技術水(shui)平的(de)(de)(de)提升和檢測費用(yong)的(de)(de)(de)不斷(duan)降(jiang)低(di)，發展大規(gui)模個(ge)體化(hua)基(ji)因(yin)檢測在(zai)不久的(de)(de)(de)將來(lai)(lai)成為可能。同時，藥物易感(gan)性基(ji)因(yin)和疾病發生的(de)(de)(de)易感(gan)基(ji)因(yin)的(de)(de)(de)檢測的(de)(de)(de)深入開展，個(ge)體化(hua)醫療將在(zai)基(ji)因(yin)檢測的(de)(de)(de)基(ji)礎上得(de)以實現。有理由相(xiang)信，隨著人們(men)生活(huo)水(shui)平的(de)(de)(de)不斷(duan)提高(gao)和健康(kang)意識不斷(duan)增強，基(ji)因(yin)檢測在(zai)未來(lai)(lai)醫學發展中應用(yong)前(qian)景將十分可觀。