【基因測(ce)序(xu)是什么】基因測(ce)序(xu)有什么用 基因測(ce)序(xu)原理技術
隨著基因測序(xu)(xu)(xu)技(ji)術的(de)(de)(de)發展(zhan)和費(fei)用的(de)(de)(de)降低，現在普通人(ren)也可(ke)以(yi)在可(ke)承受的(de)(de)(de)經濟范(fan)圍內進(jin)行個(ge)(ge)體(ti)測序(xu)(xu)(xu)分(fen)析，測序(xu)(xu)(xu)技(ji)術成為精準(zhun)醫學(xue)發展(zhan)和個(ge)(ge)體(ti)化治療(liao)中一(yi)個(ge)(ge)非常重要的(de)(de)(de)工具，我們即將迎來一(yi)個(ge)(ge)全(quan)民測序(xu)(xu)(xu)的(de)(de)(de)時(shi)代。而這樣(yang)一(yi)種強大(da)的(de)(de)(de)工具在科(ke)學(xue)家們的(de)(de)(de)手中又可(ke)以(yi)發揮出(chu)(chu)更(geng)大(da)價值，挖掘出(chu)(chu)更(geng)有深度的(de)(de)(de)信息。基因測序(xu)(xu)(xu)技(ji)術在精準(zhun)醫學(xue)中得到了(le)哪些(xie)應(ying)用呢？小(xiao)編從以(yi)下幾(ji)個(ge)(ge)方面(mian)結合(he)已發表文章進(jin)行了(le)總結。
基因測序助力癌癥研究尋找治療靶點
在2016年4月8日那期(qi)Science期(qi)刊上，美國布羅德研究(jiu)(jiu)所(suo)Aviv Regev的領(ling)導的癌癥研究(jiu)(jiu)團隊通過與麻(ma)省(sheng)理(li)工學(xue)院副教授、單(dan)細(xi)(xi)胞(bao)分析(xi)先鋒Alex Shalek合作，利(li)用(yong)單(dan)細(xi)(xi)胞(bao)RNA-seq方法每(mei)(mei)次(ci)一(yi)個細(xi)(xi)胞(bao)地研究(jiu)(jiu)整個腫(zhong)(zhong)(zhong)瘤(liu)(liu)以便(bian)確定哪些類型的細(xi)(xi)胞(bao)存(cun)在于腫(zhong)(zhong)(zhong)瘤(liu)(liu)中。他(ta)們(men)不僅(jin)分析(xi)了(le)惡性腫(zhong)(zhong)(zhong)瘤(liu)(liu)細(xi)(xi)胞(bao)，而且也分析(xi)了(le)腫(zhong)(zhong)(zhong)瘤(liu)(liu)內所(suo)有(you)不同類型的細(xi)(xi)胞(bao)。這(zhe)(zhe)是首次(ci)開展這(zhe)(zhe)樣(yang)的研究(jiu)(jiu)。如(ru)今(jin)，他(ta)們(men)知道(dao)每(mei)(mei)種(zhong)腫(zhong)(zhong)(zhong)瘤(liu)(liu)的細(xi)(xi)胞(bao)組成(cheng)，也知道(dao)每(mei)(mei)種(zhong)類型的細(xi)(xi)胞(bao)的基因(yin)(yin)表達模式(shi)，這(zhe)(zhe)樣(yang)就(jiu)能夠回(hui)個頭去重新分析(xi)一(yi)些大體積腫(zhong)(zhong)(zhong)瘤(liu)(liu)測序數據（比如(ru)，癌癥基因(yin)(yin)組圖譜）以便(bian)從現存(cun)的數據中找出細(xi)(xi)胞(bao)如(ru)何相(xiang)互作用(yong)和一(yi)定程度上利(li)用(yong)細(xi)(xi)胞(bao)重建大塊(kuai)腫(zhong)(zhong)(zhong)瘤(liu)(liu)樣(yang)品的整體行為。
在一(yi)篇發(fa)表在國(guo)際學(xue)術期刊(kan)Nature Communication上的(de)文章中，來自美國(guo)的(de)科學(xue)家(jia)們對109名胰(yi)腺(xian)導管腺(xian)癌（PDA）病人進行了(le)(le)全(quan)外顯(xian)子測(ce)序，發(fa)現了(le)(le)PDA中的(de)基因突變(bian)多樣性(xing)，并且為(wei)發(fa)現PDA治療靶(ba)點提(ti)供了(le)(le)重要信(xin)息。
在該項(xiang)研(yan)究(jiu)中(zhong)，研(yan)究(jiu)人員為方便檢(jian)測(ce)(ce)基因(yin)突(tu)變(bian)(bian)，同時(shi)移除非腫(zhong)(zhong)瘤(liu)(liu)(liu)(liu)性組織的污染，他們利用顯(xian)微(wei)(wei)切割(ge)的方法(fa)將癌癥(zheng)患者(zhe)的腫(zhong)(zhong)瘤(liu)(liu)(liu)(liu)組織進行了異(yi)種移植并建立了細胞系。隨后對109例進行過(guo)(guo)顯(xian)微(wei)(wei)切割(ge)的PDA病(bing)例進行了全外(wai)顯(xian)子(zi)測(ce)(ce)序，經過(guo)(guo)顯(xian)微(wei)(wei)切割(ge)操作后，腫(zhong)(zhong)瘤(liu)(liu)(liu)(liu)細胞得(de)到富集并增強了對基因(yin)突(tu)變(bian)(bian)的檢(jian)測(ce)(ce)。研(yan)究(jiu)人員通(tong)過(guo)(guo)分(fen)析發(fa)現導致PDA發(fa)生(sheng)的病(bing)因(yin)事件與(yu)腫(zhong)(zhong)瘤(liu)(liu)(liu)(liu)突(tu)變(bian)(bian)譜具(ju)有明(ming)顯(xian)相(xiang)關(guan)性。
基因測序幫助尋找生物標記物 助力疾病診斷
在(zai)歐洲泌尿外(wai)科協會的(de)研(yan)(yan)究(jiu)者(zhe)公布(bu)的(de)一(yi)項最新(xin)研(yan)(yan)究(jiu)成果(guo)中(zhong)，研(yan)(yan)究(jiu)者(zhe)對(dui)64份(fen)前(qian)列腺組織樣(yang)本(ben)進(jin)(jin)行研(yan)(yan)究(jiu)，對(dui)每一(yi)種樣(yang)本(ben)中(zhong)的(de)2億個序列進(jin)(jin)行閱(yue)讀分析，結果(guo)研(yan)(yan)究(jiu)者(zhe)發現在(zai)腫瘤和控制樣(yang)本(ben)中(zhong)有超過(guo)2000個基因都表(biao)現出了(le)明(ming)顯的(de)差異(yi)(yi)性(xing)，其(qi)中(zhong)有些相比已知的(de)前(qian)列腺癌標志物而言表(biao)現出了(le)較高的(de)特(te)異(yi)(yi)性(xing)和敏(min)感性(xing);其(qi)中(zhong)一(yi)種名為TAPIR的(de)非(fei)編碼RNAs則(ze)可以有效抑(yi)制癌細胞的(de)生長，盡(jin)管其(qi)可以轉化為臨床有用的(de)治療靶點還為時尚早(zao)。
研(yan)究者在前列(lie)腺癌(ai)患(huan)者的(de)(de)尿液中(zhong)發現了這些(xie)生物(wu)標(biao)志(zhi)物(wu)，檢(jian)測結(jie)果顯(xian)示其(qi)可以幫(bang)助進(jin)行準確的(de)(de)前列(lie)腺癌(ai)檢(jian)測，基于相(xiang)關研(yan)究結(jie)果，研(yan)究人(ren)員決(jue)定開發一種(zhong)進(jin)行前列(lie)腺癌(ai)早期診斷的(de)(de)高特異性(xing)(xing)及(ji)敏感性(xing)(xing)的(de)(de)，且基于尿液的(de)(de)檢(jian)測手段;這種(zhong)檢(jian)測方法基于對多(duo)個(ge)生物(wu)標(biao)志(zhi)物(wu)的(de)(de)組(zu)合，相(xiang)比單(dan)一標(biao)志(zhi)物(wu)而(er)言將表現出較高的(de)(de)特異性(xing)(xing)。
基因測序幫助監測全球性疾病暴發
在(zai)一篇發(fa)表于Nature雜(za)志(zhi)上的(de)報道中，來自(zi)伯明(ming)翰大(da)學(xue)的(de)研究人員解釋了如何(he)利用基(ji)因組(zu)測(ce)序(xu)的(de)技術來快速實現對疾病暴發(fa)的(de)有效監測(ce);文章中他們開發(fa)了一種手提(ti)箱(xiang)式的(de)基(ji)因組(zu)測(ce)序(xu)“實驗室”，其中包含有一種新型的(de)DNA測(ce)序(xu)儀，最(zui)初該設備用于2015年4月(yue)在(zai)幾內亞對埃(ai)博拉病人的(de)樣本進行檢測(ce)。
這項研究(jiu)中，研究(jiu)人員利用這種(zhong)便(bian)攜式的(de)(de)DNA測序儀在整個基因組庫中鑒別出了(le)新型的(de)(de)單核(he)苷酸多態性（SNPs），目前當測序工作局(ju)限(xian)于實(shi)驗室的(de)(de)時(shi)候，這種(zhong)便(bian)攜式機(ji)器(qi)的(de)(de)開發對于有(you)效進(jin)行疾病暴發的(de)(de)監測而言非(fei)常重要(yao)，研究(jiu)者們還希(xi)望(wang)可(ke)以(yi)將這種(zhong)便(bian)攜式的(de)(de)機(ji)器(qi)應用于別的(de)(de)領(ling)域的(de)(de)研究(jiu)中，比如癌癥研究(jiu)等(deng)。
在(zai)另外一項(xiang)研(yan)(yan)究中，來(lai)自英國牛津大學(xue)和(he)巴西Evandro Chagas研(yan)(yan)究所等機(ji)構的(de)研(yan)(yan)究人員對(dui)巴西的(de)寨卡病毒暴發進(jin)(jin)行首(shou)個基(ji)因(yin)組分析，從(cong)而提供(gong)關于(yu)這種病毒如何和(he)何時可(ke)能進(jin)(jin)入美洲方面的(de)新信(xin)息。
研究人員對7株巴西寨卡病毒毒株的基因組進行測序，包括一株毒株來自一例致命的成年人病例和另一株毒株來自一名頭小畸型新生兒。
1、第一代測序
1.1 Sanger 測序
采用的(de)(de)(de)(de)是直接測序(xu)法。1977年，Frederick Sanger 等發明(ming)了雙(shuang)脫氧(yang)鏈末端(duan)終(zhong)止法，這一(yi)技術(shu)隨后(hou)成(cheng)為(wei)(wei)最為(wei)(wei)常用的(de)(de)(de)(de)基因測序(xu)技術(shu)。2001 年，Allan Maxam 和 Walter Gibert 發 明(ming)了 Sanger 測序(xu)法，并在(zai)(zai)此后(hou)的(de)(de)(de)(de) 10 年里成(cheng)為(wei)(wei)基因檢測的(de)(de)(de)(de)金標準(zhun)。其基本原理即雙(shuang)脫氧(yang)核苷(gan)三(san)磷酸（dideoxyribonucleoside triphosphate，ddNTP）缺乏PCR 延伸所(suo)需的(de)(de)(de)(de) 3'-OH，因此每當 DNA 鏈加入(ru)分(fen)子 ddNTP，延伸便終(zhong)止。每一(yi)次 DNA 測序(xu)是由 4個獨(du)立(li)的(de)(de)(de)(de)反應(ying)(ying)組成(cheng)，將模板、引物(wu)和 4 種含(han)有不(bu)同(tong)(tong)(tong)的(de)(de)(de)(de)放射(she)性同(tong)(tong)(tong)位素標記(ji)的(de)(de)(de)(de)核苷(gan)酸的(de)(de)(de)(de) ddNTP 分(fen)別(bie)(bie)與DNA 聚合酶混(hun)合形成(cheng)長短不(bu)一(yi)的(de)(de)(de)(de)片段(duan)，大(da)量起始點相(xiang)同(tong)(tong)(tong)、終(zhong)止點不(bu)同(tong)(tong)(tong)的(de)(de)(de)(de) DNA 片段(duan)存(cun)在(zai)(zai)于反應(ying)(ying)體系(xi)中，具(ju)有單(dan)個堿基差別(bie)(bie)的(de)(de)(de)(de) DNA 序(xu)列(lie)(lie)可(ke)以(yi)被聚丙(bing)烯(xi)酰胺變性凝膠電泳分(fen)離出來(lai)，得到放射(she)性同(tong)(tong)(tong)位素自顯影條帶(dai)。依據(ju)電泳條帶(dai)讀取 DNA 雙(shuang)鏈的(de)(de)(de)(de)堿基序(xu)列(lie)(lie)。
人(ren)類基(ji)因(yin)(yin)組的(de)(de)(de)(de)測(ce)(ce)序(xu)正是基(ji)于(yu)(yu)該(gai)(gai)技術完成的(de)(de)(de)(de)。Sanger 測(ce)(ce)序(xu)這種(zhong)直(zhi)(zhi)接(jie)測(ce)(ce)序(xu)方法(fa)具有高度的(de)(de)(de)(de)準確性和簡單(dan)、快(kuai)捷等特點。目前，依然對于(yu)(yu)一些(xie)臨(lin)床上(shang)小(xiao)樣(yang)本遺傳疾病基(ji)因(yin)(yin)的(de)(de)(de)(de)鑒定(ding)具有很高的(de)(de)(de)(de)實用(yong)價值(zhi)。例如，臨(lin)床上(shang)采用(yong) Sanger 直(zhi)(zhi)接(jie)測(ce)(ce)序(xu) FGFR 2 基(ji)因(yin)(yin)證實單(dan)基(ji)因(yin)(yin) Apert 綜合征和直(zhi)(zhi)接(jie)測(ce)(ce)序(xu) TCOF1 基(ji)因(yin)(yin)可以檢出多(duo)達 90% 的(de)(de)(de)(de)與 Treacher Collins 綜合征相關(guan)的(de)(de)(de)(de)突變。值(zhi)得注意的(de)(de)(de)(de)是，Sanger 測(ce)(ce)序(xu)是針對已知致病基(ji)因(yin)(yin)的(de)(de)(de)(de)突變位點設計引物，進行 PCR 直(zhi)(zhi)接(jie)擴增(zeng)測(ce)(ce)序(xu)。單(dan)個突變點的(de)(de)(de)(de)擴增(zeng)包括該(gai)(gai)位點在內(nei)的(de)(de)(de)(de)外顯(xian)子(zi)(zi)片段(duan)即可，不必將該(gai)(gai)點所在基(ji)因(yin)(yin)的(de)(de)(de)(de)全部外顯(xian)子(zi)(zi)都(dou)擴增(zeng)。
因(yin)(yin)此，應明確(que)定(ding)位(wei)(wei)要(yao)擴增的(de)(de)位(wei)(wei)點(dian)(dian)所在的(de)(de)基因(yin)(yin)外顯子(zi)(zi)和該點(dian)(dian)的(de)(de)具體位(wei)(wei)置，設計包括該點(dian)(dian)在內的(de)(de)上下游 150 ~ 200 bp 的(de)(de)外顯子(zi)(zi)片段引物。此外，盡管有(you)NGS 的(de)(de)出(chu)現，但 Sanger 測(ce)序(xu)對(dui)于有(you)致(zhi)病(bing)基因(yin)(yin)位(wei)(wei)點(dian)(dian)明確(que)并且(qie)數(shu)量有(you)限(xian)的(de)(de)單基因(yin)(yin)遺(yi)傳疾(ji)病(bing)的(de)(de)致(zhi)病(bing)基因(yin)(yin)的(de)(de)檢測(ce)是非(fei)常經(jing)濟和高效的(de)(de)。到(dao)目前為止，Sanger 測(ce)序(xu)仍然是作為基因(yin)(yin)檢測(ce)的(de)(de)金標準，也是 NGS 基因(yin)(yin)檢測(ce)后進行家系內和正常對(dui)照組驗證的(de)(de)主要(yao)手(shou)段。
值得注(zhu)意的(de)(de)是(shi)，Sanger 測(ce)(ce)序(xu)(xu)目的(de)(de)是(shi)尋找與疾(ji)病(bing)有關(guan)的(de)(de)特(te)定的(de)(de)基(ji)因突(tu)變。對于(yu)沒有明確(que)候(hou)選(xuan)基(ji)因或候(hou)選(xuan)基(ji)因數(shu)量較多的(de)(de)大(da)樣本病(bing)例(li)篩查是(shi)難(nan)以(yi)完(wan)成的(de)(de)，此類測(ce)(ce)序(xu)(xu)研究還(huan)要依靠(kao)具有高通量測(ce)(ce)序(xu)(xu)能(neng)(neng)(neng)力的(de)(de) NGS。雖然 Sanger 測(ce)(ce)序(xu)(xu)具有高度的(de)(de)分析準確(que)性，但(dan)其準確(que)性還(huan)取決于(yu)測(ce)(ce)序(xu)(xu)儀器以(yi)及(ji)測(ce)(ce)序(xu)(xu)條(tiao)件的(de)(de)設定。另外，Sanger 測(ce)(ce)序(xu)(xu)不能(neng)(neng)(neng)檢(jian)測(ce)(ce)出大(da)片段缺失或拷貝(bei)數(shu)變異等(deng)基(ji)因突(tu)變的(de)(de)類型，因此對于(yu)一些與此相關(guan)的(de)(de)遺傳性疾(ji)病(bing)還(huan)不能(neng)(neng)(neng)做出基(ji)因學診斷。
1.2 連鎖分析
采用的(de)(de)(de)是(shi)間接測序(xu)(xu)法(fa)。在(zai) NGS 出(chu)現(xian)(xian)之前，國(guo)際通(tong)(tong)用的(de)(de)(de)疾(ji)病(bing)基(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)定(ding)位(wei)(wei)(wei)(wei)(wei)克隆(long)策略是(shi)建立在(zai)大規模全(quan)基(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)掃描和(he)連(lian)(lian)鎖(suo)(suo)分析基(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)礎上的(de)(de)(de)位(wei)(wei)(wei)(wei)(wei)置候(hou)選基(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)克隆(long)。人類的(de)(de)(de)染(ran)色(se)(se)體(ti)(ti)成對出(chu)現(xian)(xian)，一(yi)(yi)(yi)條來(lai)自(zi)父親，一(yi)(yi)(yi)條來(lai)自(zi)母(mu)親，每一(yi)(yi)(yi)對染(ran)色(se)(se)體(ti)(ti)在(zai)同(tong)(tong)樣的(de)(de)(de)位(wei)(wei)(wei)(wei)(wei)置上擁有(you)相同(tong)(tong)的(de)(de)(de)基(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)，但是(shi)其序(xu)(xu)列并不完全(quan)相同(tong)(tong)，被稱為(wei)(wei)父系(xi)(xi)和(he)母(mu)系(xi)(xi)等位(wei)(wei)(wei)(wei)(wei)基(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)。遺(yi)(yi)(yi)傳(chuan)(chuan)(chuan)(chuan)標(biao)(biao)記(ji)(ji)(ji)(ji)是(shi)指在(zai)人群中(zhong)表現(xian)(xian)出(chu)多(duo)態(tai)現(xian)(xian)象的(de)(de)(de) DNA 序(xu)(xu)列，可(ke)追蹤染(ran)色(se)(se)體(ti)(ti)、染(ran)色(se)(se)體(ti)(ti)某(mou)一(yi)(yi)(yi)節段或(huo)某(mou)個(ge)基(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)座(zuo)在(zai)家(jia)系(xi)(xi)中(zhong)傳(chuan)(chuan)(chuan)(chuan)遞的(de)(de)(de)任何一(yi)(yi)(yi)種遺(yi)(yi)(yi)傳(chuan)(chuan)(chuan)(chuan)特(te)性(xing)(xing)。它存(cun)(cun)(cun)在(zai)于(yu)每一(yi)(yi)(yi)個(ge)人，但大小和(he)序(xu)(xu)列有(you)差別(bie)，具有(you)可(ke)遺(yi)(yi)(yi)傳(chuan)(chuan)(chuan)(chuan)性(xing)(xing)和(he)可(ke)識別(bie)性(xing)(xing)。目前采用第二代(dai)遺(yi)(yi)(yi)傳(chuan)(chuan)(chuan)(chuan)標(biao)(biao)記(ji)(ji)(ji)(ji)，即重復(fu)序(xu)(xu)列多(duo)態(tai)性(xing)(xing)，特(te)別(bie)是(shi)短串聯重復(fu)序(xu)(xu)列，又稱微(wei)衛星標(biao)(biao)記(ji)(ji)(ji)(ji)。連(lian)(lian)鎖(suo)(suo)分析是(shi)以(yi)(yi)連(lian)(lian)鎖(suo)(suo)這(zhe)種遺(yi)(yi)(yi)傳(chuan)(chuan)(chuan)(chuan)現(xian)(xian)象為(wei)(wei)基(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)礎，研究致病(bing)基(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)與(yu)遺(yi)(yi)(yi)傳(chuan)(chuan)(chuan)(chuan)性(xing)(xing)標(biao)(biao)記(ji)(ji)(ji)(ji)之間關系(xi)(xi)的(de)(de)(de)方(fang)法(fa)。如果控制(zhi)某(mou)一(yi)(yi)(yi)表型(xing)性(xing)(xing)狀的(de)(de)(de)基(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)附(fu)近存(cun)(cun)(cun)在(zai)遺(yi)(yi)(yi)傳(chuan)(chuan)(chuan)(chuan)標(biao)(biao)記(ji)(ji)(ji)(ji)，那(nei)么(me)利用某(mou)個(ge)遺(yi)(yi)(yi)傳(chuan)(chuan)(chuan)(chuan)標(biao)(biao)記(ji)(ji)(ji)(ji)與(yu)某(mou)個(ge)擬(ni)定(ding)位(wei)(wei)(wei)(wei)(wei)的(de)(de)(de)基(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)之間是(shi)否(fou)存(cun)(cun)(cun)在(zai)連(lian)(lian)鎖(suo)(suo)關系(xi)(xi)，以(yi)(yi)及連(lian)(lian)鎖(suo)(suo)的(de)(de)(de)緊密程度就(jiu)能(neng)將(jiang)該基(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)定(ding)位(wei)(wei)(wei)(wei)(wei)到染(ran)色(se)(se)體(ti)(ti)某(mou)一(yi)(yi)(yi)位(wei)(wei)(wei)(wei)(wei)置上。1986 年(nian) Morton 等提出(chu)優(you)勢對數記(ji)(ji)(ji)(ji)分法(fa)（og odds score method，LOD），主要檢測兩(liang)基(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)以(yi)(yi)某(mou)一(yi)(yi)(yi)重組率連(lian)(lian)鎖(suo)(suo)時(shi)的(de)(de)(de)似然性(xing)(xing)。LOD 值為(wei)(wei)正，支持連(lian)(lian)鎖(suo)(suo)；LOD 值為(wei)(wei)負(fu)，則否(fou)定(ding)連(lian)(lian)鎖(suo)(suo)。通(tong)(tong)過計算家(jia)系(xi)(xi)中(zhong)的(de)(de)(de)微(wei)衛星標(biao)(biao)記(ji)(ji)(ji)(ji)與(yu)致病(bing)位(wei)(wei)(wei)(wei)(wei)點之間的(de)(de)(de) LOD 值，可(ke)以(yi)(yi)初步估算二者(zhe)間的(de)(de)(de)遺(yi)(yi)(yi)傳(chuan)(chuan)(chuan)(chuan)距離及連(lian)(lian)鎖(suo)(suo)程度，從而確定(ding)該基(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)在(zai)染(ran)色(se)(se)體(ti)(ti)上的(de)(de)(de)粗略位(wei)(wei)(wei)(wei)(wei)置。然后利用該區域(yu)的(de)(de)(de)染(ran)色(se)(se)體(ti)(ti)基(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)圖譜，分析定(ding)位(wei)(wei)(wei)(wei)(wei)區域(yu)內所有(you)基(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)的(de)(de)(de)功(gong)能(neng)與(yu)表達，選擇(ze)合(he)適的(de)(de)(de)候(hou)選基(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)進行(xing)突變檢測，最終將(jiang)致病(bing)基(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)定(ding)位(wei)(wei)(wei)(wei)(wei)或(huo)克隆(long)。
然(ran)而(er)，采用(yong)連鎖(suo)分(fen)析進行基(ji)因(yin)檢測存在(zai)(zai)很大(da)(da)的(de)局限性(xing)。不但(dan)所(suo)需遺(yi)傳樣(yang)本量較(jiao)大(da)(da)，一(yi)般要求提供三代及(ji)以上遺(yi)傳家系(xi)患者(zhe)血樣(yang)，而(er)且數據量大(da)(da)、處理復雜、產出速度較(jiao)慢、定(ding)位(wei)不夠精確（一(yi)般只能定(ding)位(wei)在(zai)(zai)染(ran)色體某一(yi)區間(jian)），這就使(shi)得(de)研究工作繁重(zhong)和定(ding)位(wei)基(ji)因(yin)的(de)時間(jian)周期(qi)特別(bie)長。目前，連鎖(suo)分(fen)析采用(yong)的(de)單核苷酸(suan)多(duo)肽(tai)性(xing)和短串聯重(zhong)復序列還在(zai)(zai)使(shi)用(yong)，但(dan)經(jing)典的(de)間(jian)接測序方法，如單鏈構象多(duo)肽(tai)性(xing)、變性(xing)梯度凝膠電泳和異源雙(shuang)鏈分(fen)析在(zai)(zai)美國(guo)已被淘(tao)汰，而(er)在(zai)(zai)發展中國(guo)家作為研究手段還在(zai)(zai)有(you)限使(shi)用(yong)。
2、新一代測序（NGS）
主(zhu) 要 包 括 全 基 因(yin) 組(zu) 重 測(ce)(ce) 序(xu)（whole-genomesequencing，WGS）、全外顯(xian)子組(zu)測(ce)(ce)序(xu)（whole-exomesequencing，WES）和(he)(he)目標區域測(ce)(ce)序(xu)（Targeted regionssequencing，TRS），它們同(tong)屬于新一代(dai)測(ce)(ce)序(xu)技術。總體而言，NGS 技術具有通量大(da)、時間短(duan)、精(jing)確(que)(que)度高和(he)(he)信息量豐(feng)富等優點(dian)，使得遺傳學(xue)者可以(yi)在短(duan)時間內(nei)對感(gan)興趣的基因(yin)進行精(jing)確(que)(que)定位。但這些不同(tong)的測(ce)(ce)序(xu)技術在測(ce)(ce)序(xu)范(fan)圍(wei)、數據分析量以(yi)及(ji)測(ce)(ce)序(xu)費用和(he)(he)時間等方面又有很大(da)差別(bie)，如(ru)果選擇適(shi)合的方法，對于臨(lin)床診(zhen)斷和(he)(he)科學(xue)研究將起(qi)到事(shi)半(ban)功倍的作用。
2.1 目標區域測序
目(mu)前(qian)常(chang)用(yong)的(de)(de)(de)(de)(de)是基因(yin)芯片(pian)(pian)技(ji)術。其(qi)測(ce)(ce)序(xu)(xu)原理是基于 DNA 雜交(jiao)原理，利(li)(li)用(yong)目(mu)標基因(yin)組(zu)區(qu)(qu)域定(ding)制(zhi)的(de)(de)(de)(de)(de)探針與基因(yin)組(zu) DNA 進(jin)(jin)(jin)(jin)行(xing)芯片(pian)(pian)雜交(jiao)或溶液雜交(jiao)，將(jiang)目(mu)標基因(yin)區(qu)(qu)域 DNA 富(fu)集，再通(tong)過(guo)(guo)NGS 技(ji)術進(jin)(jin)(jin)(jin)行(xing)測(ce)(ce)序(xu)(xu)。其(qi)測(ce)(ce)序(xu)(xu)過(guo)(guo)程是通(tong)過(guo)(guo)把(ba)數以(yi)萬(wan)計的(de)(de)(de)(de)(de) cDNA 或寡聚核(he)苷酸置于芯片(pian)(pian)上制(zhi)成列(lie)陣，將(jiang)芯片(pian)(pian)上固定(ding)好(hao)的(de)(de)(de)(de)(de)已(yi)知(zhi)序(xu)(xu)列(lie)的(de)(de)(de)(de)(de)核(he)苷酸探針與溶液中含有熒光標記的(de)(de)(de)(de)(de)相應核(he)酸序(xu)(xu)列(lie)進(jin)(jin)(jin)(jin)行(xing)互補配對，根(gen)據測(ce)(ce)序(xu)(xu)儀所(suo)顯示強(qiang)熒光的(de)(de)(de)(de)(de)位置和強(qiang)度，獲取每組(zu)點(dian)陣列(lie)信息，再利(li)(li)用(yong)生(sheng)物(wu)信息學算法(fa)確(que)(que)定(ding)目(mu)的(de)(de)(de)(de)(de)靶核(he)苷酸的(de)(de)(de)(de)(de)序(xu)(xu)列(lie)組(zu)成。測(ce)(ce)序(xu)(xu)所(suo)選(xuan)定(ding)的(de)(de)(de)(de)(de)目(mu)標區(qu)(qu)域可以(yi)是連續的(de)(de)(de)(de)(de) DNA 序(xu)(xu)列(lie)，也可以(yi)是分布在(zai)同(tong)(tong)(tong)一(yi)個染(ran)色體(ti)不同(tong)(tong)(tong)區(qu)(qu)域或不同(tong)(tong)(tong)染(ran)色體(ti)上的(de)(de)(de)(de)(de)片(pian)(pian)段。目(mu)標區(qu)(qu)域測(ce)(ce)序(xu)(xu)技(ji)術，對于以(yi)往(wang)通(tong)過(guo)(guo)連鎖分析(xi)將(jiang)基因(yin)突變(bian)鎖定(ding)在(zai)染(ran)色體(ti)某一(yi)片(pian)(pian)段區(qu)(qu)域內，但無法(fa)找出(chu)突變(bian)是一(yi)個非常(chang)好(hao)的(de)(de)(de)(de)(de)進(jin)(jin)(jin)(jin)一(yi)步檢(jian)測(ce)(ce)手段。2010 年，Nicholas等使用(yong)基因(yin)分型(xing)芯片(pian)(pian)聯合連鎖分析(xi)技(ji)術，成功發現頭小畸形(xing)的(de)(de)(de)(de)(de)新基因(yin) WDR62，文(wen)章發表(biao)在(zai)《NatGenet》雜志。類似的(de)(de)(de)(de)(de)研究在(zai)家(jia)族(zu)性(xing)胰腺癌中確(que)(que)定(ding) 8 個候選(xuan)變(bian)異位點(dian)和在(zai)家(jia)族(zu)性(xing)滲出(chu)性(xing)玻璃體(ti)視網膜(mo)病(bing)變(bian)發現易感基因(yin) TSPAN12。
基(ji)因芯(xin)(xin)片(pian)(pian)測(ce)序技術可(ke)以將經過連(lian)鎖(suo)(suo)分析(xi)鎖(suo)(suo)定了目標(biao)(biao)范圍或(huo)經過全基(ji)因組篩選的(de)(de)(de)特定基(ji)因或(huo)區(qu)域進行更深一層(ceng)的(de)(de)(de)研究，是解決連(lian)鎖(suo)(suo)分析(xi)無法發現致病基(ji)因的(de)(de)(de)有效手段。基(ji)因芯(xin)(xin)片(pian)(pian)技術對于已(yi)知基(ji)因突變的(de)(de)(de)篩查具有明顯優勢，可(ke)以快速、全面地檢測(ce)出目標(biao)(biao)基(ji)因突變。同時(shi)，由(you)于目標(biao)(biao)區(qu)域受到了限(xian)制，測(ce)序范圍大幅度減(jian)少，測(ce)序時(shi)間和費用相應降低。但基(ji)因芯(xin)(xin)片(pian)(pian)檢測(ce)所需要的(de)(de)(de) DNA 的(de)(de)(de)量(liang)要大，由(you)于已(yi)提取的(de)(de)(de) DNA 存在(zai)降解的(de)(de)(de)風(feng)險(xian)，用于基(ji)因芯(xin)(xin)片(pian)(pian)研究的(de)(de)(de)血標(biao)(biao)本最好(hao)是冰凍的(de)(de)(de)全血，這(zhe)樣(yang)可(ke)以使用于檢測(ce) DNA 的(de)(de)(de)量(liang)有充分保證。
2.2 全外顯子組測序 （WES）
外(wai)顯子(zi)組(zu)是(shi)單(dan)個(ge)個(ge)體的(de)(de)(de)基(ji)(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)組(zu) DNA 上(shang)所有蛋白質編碼(ma)序列的(de)(de)(de)總合。人類外(wai)顯子(zi)組(zu)序列約占人類全(quan)部基(ji)(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)組(zu)序列的(de)(de)(de) 1%，但大約包含 85% 的(de)(de)(de)致(zhi)病(bing)突(tu)變(bian)。WES 是(shi)利用(yong)序列捕(bu)獲(huo)技(ji)術(shu)將(jiang)全(quan)外(wai)顯子(zi)區域 DNA 捕(bu)捉并富集后進行高通量測(ce)(ce)序的(de)(de)(de)基(ji)(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)分析(xi)方法(fa)。采用(yong)的(de)(de)(de)技(ji)術(shu)平臺(tai)主(zhu)要(yao)是(shi)羅氏(shi)公司的(de)(de)(de) SeqCap EZ 全(quan)外(wai)顯子(zi)捕(bu)獲(huo)系統，Illumina 公司的(de)(de)(de) Solexa 技(ji)術(shu)和(he) Agilent 公司的(de)(de)(de) SureSelect 外(wai)顯子(zi)靶向序列富集系統。其(qi)捕(bu)獲(huo)的(de)(de)(de)目標區在 34 ~ 62 M 之間，不(bu)僅包括編碼(ma)區同時(shi)也加(jia)入了(le)部分非編碼(ma)區。NGS 的(de)(de)(de)測(ce)(ce)序過(guo)程(cheng)主(zhu)要(yao)包括DNA 測(ce)(ce)序文庫的(de)(de)(de)制(zhi)備、錨定橋接、PCR 擴增、單(dan)堿基(ji)(ji)(ji)(ji)延伸測(ce)(ce)序和(he)數據(ju)分析(xi)。研究者根(gen)據(ju)測(ce)(ce)序儀捕(bu)獲(huo)到(dao)在測(ce)(ce)序過(guo)程(cheng)中(zhong)摻入有不(bu)同熒光(guang)標記堿基(ji)(ji)(ji)(ji)片(pian)段，經計(ji)算機將(jiang)熒光(guang)信號(hao)轉化(hua)成不(bu)同顏色(se)的(de)(de)(de)測(ce)(ce)序峰圖和(he)堿基(ji)(ji)(ji)(ji)序列。基(ji)(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)測(ce)(ce)序結果與NCBI的(de)(de)(de)SNP數據(ju)庫、千人基(ji)(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)組(zu)數據(ju)庫等國(guo)際權威數據(ju)庫比對，最終(zhong)確(que)定是(shi)否為突(tu)變(bian)基(ji)(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)。
自NGS 技術問世以來(lai)，利用 WES 在(zai)(zai)臨床疾病(bing)(bing)(bing)(bing)致病(bing)(bing)(bing)(bing)基因(yin)(yin)的(de)(de)鑒定研究(jiu)中(zhong)(zhong)(zhong)取(qu)得前所未有(you)的(de)(de)成果。這(zhe)些成果不僅集中(zhong)(zhong)(zhong)在(zai)(zai)單基因(yin)(yin)遺傳疾病(bing)(bing)(bing)(bing)，還在(zai)(zai)多(duo)基因(yin)(yin)影響(xiang)的(de)(de)復雜疾病(bing)(bing)(bing)(bing)中(zhong)(zhong)(zhong)獲得大量(liang)相關基因(yin)(yin)的(de)(de)發現(xian)。在(zai)(zai)單基因(yin)(yin)遺傳性(xing)(xing)疾病(bing)(bing)(bing)(bing)中(zhong)(zhong)(zhong)，如視網(wang)膜色(se)素(su)變性(xing)(xing)、終端骨發育不良(liang)等發現(xian)新(xin)基因(yin)(yin)或已知基因(yin)(yin)新(xin)突變。在(zai)(zai)一些罕見的(de)(de)疾病(bing)(bing)(bing)(bing)中(zhong)(zhong)(zhong)，如 Kabuki 綜合征、家族性(xing)(xing)混合型低(di)脂血癥(zheng)和脊髓小腦共濟(ji)失調癥(zheng)等疾病(bing)(bing)(bing)(bing)中(zhong)(zhong)(zhong)發現(xian)新(xin)的(de)(de)致病(bing)(bing)(bing)(bing)基因(yin)(yin)。同(tong)時，在(zai)(zai)小細胞肺癌、慢性(xing)(xing)淋巴細胞性(xing)(xing)白血病(bing)(bing)(bing)(bing)等腫(zhong)瘤研究(jiu)和諸如肥胖癥(zheng)、腦皮質發育不良(liang)等復雜疾病(bing)(bing)(bing)(bing)的(de)(de)研究(jiu)中(zhong)(zhong)(zhong)也(ye)取(qu)得豐碩成果。
WES 技術(shu)在(zai)(zai)篩查(cha)范圍和(he)檢出率等(deng)方面較(jiao)其他(ta)測序(xu)技術(shu)具(ju)有(you)明顯的(de)(de)(de)(de)(de)優勢。例如(ru)，對于采用 Sanger測序(xu)和(he)基(ji)(ji)因(yin)芯(xin)片(pian)測序(xu)不(bu)能篩查(cha)出基(ji)(ji)因(yin)的(de)(de)(de)(de)(de)樣本，可以(yi)(yi)采用 WES 來進(jin)一(yi)步(bu)基(ji)(ji)因(yin)篩查(cha)鑒定(ding)(ding)。應(ying)用 WES技術(shu)能夠(gou)獲(huo)得較(jiao)傳(chuan)統 Sanger 等(deng)方法對編(bian)碼(ma)區測序(xu)更(geng)深的(de)(de)(de)(de)(de)覆(fu)蓋度和(he)更(geng)準(zhun)確的(de)(de)(de)(de)(de)數據(ju)。由(you)于信(xin)息量的(de)(de)(de)(de)(de)大(da)幅度增加，WES 可以(yi)(yi)獲(huo)得更(geng)多(duo)(duo)個體的(de)(de)(de)(de)(de)編(bian)碼(ma)區信(xin)息，因(yin)此成為檢測致病(bing)(bing)(bing)基(ji)(ji)因(yin)和(he)易感基(ji)(ji)因(yin)位點的(de)(de)(de)(de)(de)有(you)效手段。與連(lian)(lian)鎖分(fen)析定(ding)(ding)位方法比(bi)較(jiao)，WES 對家系的(de)(de)(de)(de)(de)要求并不(bu)十分(fen)嚴(yan)格(ge)，在(zai)(zai)單(dan)基(ji)(ji)因(yin)遺傳(chuan)病(bing)(bing)(bing)同一(yi)家系中有(you) 2 ~3 個患者和(he) 1 個正常人即可進(jin)行致病(bing)(bing)(bing)基(ji)(ji)因(yin)的(de)(de)(de)(de)(de)鑒定(ding)(ding)研(yan)(yan)究(jiu)，而不(bu)需要連(lian)(lian)續三代的(de)(de)(de)(de)(de)遺傳(chuan)家系。由(you)于不(bu)需要嚴(yan)格(ge)的(de)(de)(de)(de)(de)三代以(yi)(yi)上(shang)的(de)(de)(de)(de)(de)遺傳(chuan)家系，WES 使以(yi)(yi)前不(bu)能進(jin)行研(yan)(yan)究(jiu)的(de)(de)(de)(de)(de)家系成為可能。不(bu)僅(jin)對于單(dan)基(ji)(ji)因(yin)遺傳(chuan)病(bing)(bing)(bing)是(shi)一(yi)個很好(hao)的(de)(de)(de)(de)(de)研(yan)(yan)究(jiu)手段，對于許多(duo)(duo)常見病(bing)(bing)(bing)，如(ru)腫瘤、糖尿病(bing)(bing)(bing)等(deng)疾病(bing)(bing)(bing)也(ye)可進(jin)行大(da)規模比(bi)較(jiao)研(yan)(yan)究(jiu)。
2.3 全基因組重測序 （WGS）
WGS 是對已知基因組序列的物種進行不同個體的全基因組的測序，經過數據分析后對序列進行拼接、組裝并獲得基因組圖譜，或是對不同組織進行測序并分析體細胞突變的一種研究方法。盡管 WES 可以快速全面地找出個體基因組上的所有突變，從而找到個體間的差異，但對于外顯子以外的區域則不能有效地進行基因檢測。對于此種情況，目前還要借助WGS 進行全基因組檢測。但由于人類基因組過于龐大，一次單端全基因組測序很難達到所需要的測序深度。因此，需要重復測序或雙端測序，由此帶來測序成本的大幅度提高和由于不能達到足夠的測序深度所導致的結果準確性的降低。而對于臨床疾病診斷和普通科研工作，其高昂的檢測費用也是難以承受的。盡管如此，對于部分臨床研究和 WES 不能解決的科研課題還需要借助 WGS進行更加全面的基因檢測。
