【基(ji)(ji)因測序是(shi)什(shen)么】基(ji)(ji)因測序有什(shen)么用 基(ji)(ji)因測序原理(li)技術(shu)
隨(sui)著基(ji)因測序(xu)(xu)技術(shu)的(de)(de)(de)發展和費用的(de)(de)(de)降低，現(xian)在(zai)普通人也可(ke)以(yi)在(zai)可(ke)承受的(de)(de)(de)經濟范圍內(nei)進(jin)行個(ge)體測序(xu)(xu)分析，測序(xu)(xu)技術(shu)成為精準醫學發展和個(ge)體化治療(liao)中(zhong)一個(ge)非常重要的(de)(de)(de)工具(ju)，我們即將迎(ying)來一個(ge)全民測序(xu)(xu)的(de)(de)(de)時(shi)代(dai)。而這(zhe)樣一種強(qiang)大的(de)(de)(de)工具(ju)在(zai)科學家們的(de)(de)(de)手中(zhong)又可(ke)以(yi)發揮出更(geng)大價值，挖掘出更(geng)有深度的(de)(de)(de)信息。基(ji)因測序(xu)(xu)技術(shu)在(zai)精準醫學中(zhong)得到(dao)了(le)哪些應用呢？小編從以(yi)下幾個(ge)方面(mian)結(jie)合已(yi)發表文(wen)章進(jin)行了(le)總(zong)結(jie)。
基因測序助力癌癥研究尋找治療靶點
在(zai)2016年4月(yue)8日那期Science期刊上(shang)，美國布(bu)羅德研(yan)究(jiu)所(suo)(suo)Aviv Regev的(de)(de)領(ling)導的(de)(de)癌癥研(yan)究(jiu)團隊通過與麻省理工學院(yuan)副(fu)教授、單細(xi)胞(bao)(bao)(bao)分(fen)(fen)析(xi)(xi)先(xian)鋒(feng)Alex Shalek合(he)作，利用單細(xi)胞(bao)(bao)(bao)RNA-seq方法每次(ci)一個(ge)細(xi)胞(bao)(bao)(bao)地研(yan)究(jiu)整個(ge)腫瘤(liu)(liu)以便確定哪些(xie)類型(xing)(xing)的(de)(de)細(xi)胞(bao)(bao)(bao)存在(zai)于(yu)腫瘤(liu)(liu)中。他們不(bu)僅分(fen)(fen)析(xi)(xi)了(le)(le)惡性(xing)腫瘤(liu)(liu)細(xi)胞(bao)(bao)(bao)，而(er)且(qie)也分(fen)(fen)析(xi)(xi)了(le)(le)腫瘤(liu)(liu)內所(suo)(suo)有不(bu)同(tong)類型(xing)(xing)的(de)(de)細(xi)胞(bao)(bao)(bao)。這(zhe)是首次(ci)開展這(zhe)樣(yang)的(de)(de)研(yan)究(jiu)。如(ru)(ru)今，他們知道每種(zhong)腫瘤(liu)(liu)的(de)(de)細(xi)胞(bao)(bao)(bao)組(zu)成，也知道每種(zhong)類型(xing)(xing)的(de)(de)細(xi)胞(bao)(bao)(bao)的(de)(de)基因表達模式，這(zhe)樣(yang)就能夠回個(ge)頭去(qu)重(zhong)新分(fen)(fen)析(xi)(xi)一些(xie)大體(ti)積腫瘤(liu)(liu)測序數據（比(bi)如(ru)(ru)，癌癥基因組(zu)圖譜）以便從(cong)現(xian)存的(de)(de)數據中找出細(xi)胞(bao)(bao)(bao)如(ru)(ru)何相互作用和一定程度上(shang)利用細(xi)胞(bao)(bao)(bao)重(zhong)建大塊(kuai)腫瘤(liu)(liu)樣(yang)品的(de)(de)整體(ti)行為。
在(zai)一篇發表(biao)在(zai)國(guo)(guo)際學(xue)術(shu)期刊Nature Communication上的(de)文(wen)章中，來自美國(guo)(guo)的(de)科(ke)學(xue)家們對109名胰(yi)腺(xian)導管腺(xian)癌(ai)（PDA）病(bing)人進行(xing)了(le)全外(wai)顯(xian)子(zi)測序，發現(xian)了(le)PDA中的(de)基因突變多樣性(xing)，并且為發現(xian)PDA治療(liao)靶點提供了(le)重要(yao)信息。
在該(gai)項研究(jiu)(jiu)中，研究(jiu)(jiu)人(ren)員為(wei)方便檢測(ce)基因突(tu)(tu)變(bian)，同時(shi)移除非腫(zhong)(zhong)瘤性(xing)組織(zhi)的(de)(de)(de)污染，他們利用顯(xian)(xian)(xian)微切(qie)割(ge)(ge)的(de)(de)(de)方法將癌癥患者的(de)(de)(de)腫(zhong)(zhong)瘤組織(zhi)進(jin)(jin)行了異(yi)種移植并建立(li)了細胞(bao)(bao)系。隨后對(dui)109例進(jin)(jin)行過(guo)顯(xian)(xian)(xian)微切(qie)割(ge)(ge)的(de)(de)(de)PDA病例進(jin)(jin)行了全外顯(xian)(xian)(xian)子測(ce)序，經過(guo)顯(xian)(xian)(xian)微切(qie)割(ge)(ge)操(cao)作(zuo)后，腫(zhong)(zhong)瘤細胞(bao)(bao)得到富集(ji)并增強了對(dui)基因突(tu)(tu)變(bian)的(de)(de)(de)檢測(ce)。研究(jiu)(jiu)人(ren)員通過(guo)分析發(fa)現導致PDA發(fa)生的(de)(de)(de)病因事件與腫(zhong)(zhong)瘤突(tu)(tu)變(bian)譜具有明顯(xian)(xian)(xian)相關(guan)性(xing)。
基因測序幫助尋找生物標記物 助力疾病診斷
在歐洲泌(mi)尿外科協會的(de)(de)研(yan)(yan)究(jiu)者(zhe)公布的(de)(de)一(yi)項最新(xin)研(yan)(yan)究(jiu)成果中(zhong)(zhong)，研(yan)(yan)究(jiu)者(zhe)對(dui)64份(fen)前列腺組織(zhi)樣(yang)本(ben)進行(xing)研(yan)(yan)究(jiu)，對(dui)每一(yi)種樣(yang)本(ben)中(zhong)(zhong)的(de)(de)2億個(ge)序列進行(xing)閱(yue)讀分析(xi)，結果研(yan)(yan)究(jiu)者(zhe)發現(xian)在腫瘤和(he)控制樣(yang)本(ben)中(zhong)(zhong)有(you)(you)超過2000個(ge)基(ji)因都表現(xian)出了(le)明顯的(de)(de)差(cha)異性，其中(zhong)(zhong)有(you)(you)些(xie)相比(bi)已知(zhi)的(de)(de)前列腺癌(ai)(ai)標志物(wu)而言(yan)表現(xian)出了(le)較(jiao)高(gao)的(de)(de)特異性和(he)敏感性;其中(zhong)(zhong)一(yi)種名為(wei)(wei)TAPIR的(de)(de)非編(bian)碼RNAs則可(ke)以(yi)有(you)(you)效(xiao)抑制癌(ai)(ai)細胞的(de)(de)生長(chang)，盡(jin)管其可(ke)以(yi)轉化為(wei)(wei)臨床有(you)(you)用的(de)(de)治療靶點還為(wei)(wei)時尚早。
研(yan)(yan)究(jiu)者在(zai)前列腺(xian)癌(ai)患者的(de)(de)尿液中(zhong)發現(xian)了這些生物(wu)(wu)標志物(wu)(wu)，檢(jian)測(ce)結果顯示(shi)其可以幫助進行準確的(de)(de)前列腺(xian)癌(ai)檢(jian)測(ce)，基于(yu)(yu)相關研(yan)(yan)究(jiu)結果，研(yan)(yan)究(jiu)人員(yuan)決(jue)定開發一(yi)種進行前列腺(xian)癌(ai)早期診(zhen)斷的(de)(de)高特異性及敏感(gan)性的(de)(de)，且基于(yu)(yu)尿液的(de)(de)檢(jian)測(ce)手段;這種檢(jian)測(ce)方法基于(yu)(yu)對(dui)多個(ge)生物(wu)(wu)標志物(wu)(wu)的(de)(de)組合，相比單一(yi)標志物(wu)(wu)而言將表現(xian)出較高的(de)(de)特異性。
基因測序幫助監測全球性疾病暴發
在(zai)一(yi)篇發(fa)(fa)表(biao)于(yu)Nature雜(za)志(zhi)上的報(bao)道中，來自伯明(ming)翰大學的研究人員解釋了如何利用基因組(zu)測(ce)(ce)序的技術來快速實(shi)(shi)現對疾(ji)病暴發(fa)(fa)的有效監測(ce)(ce);文章中他們開(kai)發(fa)(fa)了一(yi)種手提箱式(shi)的基因組(zu)測(ce)(ce)序“實(shi)(shi)驗室(shi)”，其(qi)中包含(han)有一(yi)種新型的DNA測(ce)(ce)序儀，最初(chu)該設備用于(yu)2015年4月(yue)在(zai)幾(ji)內亞對埃博拉(la)病人的樣本進行檢(jian)測(ce)(ce)。
這(zhe)(zhe)項研(yan)究(jiu)(jiu)中(zhong)，研(yan)究(jiu)(jiu)人員(yuan)利用這(zhe)(zhe)種(zhong)便攜式的DNA測序儀在整個基因組庫中(zhong)鑒別出了新型的單核苷酸(suan)多態性（SNPs），目前(qian)當測序工作局限于(yu)(yu)實(shi)驗室(shi)的時候，這(zhe)(zhe)種(zhong)便攜式機(ji)器的開發(fa)對于(yu)(yu)有效(xiao)進行疾病暴發(fa)的監測而言非(fei)常(chang)重要，研(yan)究(jiu)(jiu)者(zhe)們還希望可以將這(zhe)(zhe)種(zhong)便攜式的機(ji)器應用于(yu)(yu)別的領(ling)域的研(yan)究(jiu)(jiu)中(zhong)，比如癌(ai)癥(zheng)研(yan)究(jiu)(jiu)等。
在另外(wai)一項研(yan)(yan)究(jiu)(jiu)中，來自英國牛津大(da)學和巴西(xi)Evandro Chagas研(yan)(yan)究(jiu)(jiu)所等機構的(de)(de)研(yan)(yan)究(jiu)(jiu)人(ren)員對巴西(xi)的(de)(de)寨卡病毒(du)暴發(fa)進行首個基(ji)因(yin)組(zu)分析，從而提供關于這種病毒(du)如何和何時可能(neng)進入美洲方面的(de)(de)新信息。
研究人員對7株巴西寨卡病毒毒株的基因組進行測序，包括一株毒株來自一例致命的成年人病例和另一株毒株來自一名頭小畸型新生兒。
1、第一代測序
1.1 Sanger 測序
采用(yong)(yong)的(de)是直(zhi)接測(ce)序(xu)(xu)法。1977年，Frederick Sanger 等發(fa)明(ming)了雙(shuang)脫氧(yang)鏈(lian)末端終(zhong)止法，這(zhe)一技(ji)術(shu)隨(sui)后成(cheng)為最為常(chang)用(yong)(yong)的(de)基(ji)因測(ce)序(xu)(xu)技(ji)術(shu)。2001 年，Allan Maxam 和 Walter Gibert 發(fa) 明(ming)了 Sanger 測(ce)序(xu)(xu)法，并在(zai)(zai)此后的(de) 10 年里成(cheng)為基(ji)因檢測(ce)的(de)金標準。其基(ji)本原理即雙(shuang)脫氧(yang)核(he)(he)苷三磷酸（dideoxyribonucleoside triphosphate，ddNTP）缺乏PCR 延伸(shen)所(suo)需的(de) 3'-OH，因此每(mei)當(dang) DNA 鏈(lian)加入分子 ddNTP，延伸(shen)便終(zhong)止。每(mei)一次 DNA 測(ce)序(xu)(xu)是由 4個獨立的(de)反應(ying)組成(cheng)，將(jiang)模板、引物和 4 種含有(you)不(bu)同(tong)(tong)的(de)放射性同(tong)(tong)位(wei)(wei)素(su)標記的(de)核(he)(he)苷酸的(de) ddNTP 分別與DNA 聚(ju)合(he)酶混合(he)形成(cheng)長短(duan)不(bu)一的(de)片段(duan)，大量起始(shi)點(dian)相同(tong)(tong)、終(zhong)止點(dian)不(bu)同(tong)(tong)的(de) DNA 片段(duan)存在(zai)(zai)于反應(ying)體系(xi)中(zhong)，具有(you)單(dan)個堿(jian)基(ji)差別的(de) DNA 序(xu)(xu)列可以(yi)被聚(ju)丙烯酰胺變性凝膠電泳(yong)分離出來，得到放射性同(tong)(tong)位(wei)(wei)素(su)自顯影條(tiao)帶。依據(ju)電泳(yong)條(tiao)帶讀取 DNA 雙(shuang)鏈(lian)的(de)堿(jian)基(ji)序(xu)(xu)列。
人類(lei)基(ji)(ji)因(yin)組的(de)(de)測(ce)序(xu)(xu)正(zheng)是(shi)基(ji)(ji)于該(gai)技術完成的(de)(de)。Sanger 測(ce)序(xu)(xu)這種(zhong)直接測(ce)序(xu)(xu)方法(fa)具有(you)高度(du)的(de)(de)準確性和簡單(dan)、快(kuai)捷等(deng)特點(dian)。目前(qian)，依然對(dui)于一些臨(lin)床(chuang)上(shang)小樣本遺傳(chuan)疾病(bing)基(ji)(ji)因(yin)的(de)(de)鑒定具有(you)很(hen)高的(de)(de)實用價值。例如(ru)，臨(lin)床(chuang)上(shang)采(cai)用 Sanger 直接測(ce)序(xu)(xu) FGFR 2 基(ji)(ji)因(yin)證實單(dan)基(ji)(ji)因(yin) Apert 綜合征和直接測(ce)序(xu)(xu) TCOF1 基(ji)(ji)因(yin)可(ke)以檢出多達 90% 的(de)(de)與 Treacher Collins 綜合征相關(guan)的(de)(de)突變。值得(de)注意的(de)(de)是(shi)，Sanger 測(ce)序(xu)(xu)是(shi)針對(dui)已知致病(bing)基(ji)(ji)因(yin)的(de)(de)突變位點(dian)設計引物(wu)，進(jin)行 PCR 直接擴(kuo)增測(ce)序(xu)(xu)。單(dan)個突變點(dian)的(de)(de)擴(kuo)增包括(kuo)該(gai)位點(dian)在內的(de)(de)外顯子(zi)片段即可(ke)，不必將該(gai)點(dian)所在基(ji)(ji)因(yin)的(de)(de)全(quan)部外顯子(zi)都擴(kuo)增。
因此(ci)，應明確定位(wei)要(yao)擴(kuo)增的(de)(de)(de)位(wei)點(dian)(dian)(dian)所(suo)在的(de)(de)(de)基(ji)(ji)因外(wai)顯(xian)子(zi)(zi)和該(gai)點(dian)(dian)(dian)的(de)(de)(de)具體位(wei)置，設計包括該(gai)點(dian)(dian)(dian)在內的(de)(de)(de)上下游 150 ~ 200 bp 的(de)(de)(de)外(wai)顯(xian)子(zi)(zi)片段引物。此(ci)外(wai)，盡管有NGS 的(de)(de)(de)出現(xian)，但 Sanger 測(ce)(ce)序(xu)(xu)對(dui)(dui)于有致(zhi)病(bing)(bing)基(ji)(ji)因位(wei)點(dian)(dian)(dian)明確并且數(shu)量(liang)有限(xian)的(de)(de)(de)單(dan)基(ji)(ji)因遺傳(chuan)疾(ji)病(bing)(bing)的(de)(de)(de)致(zhi)病(bing)(bing)基(ji)(ji)因的(de)(de)(de)檢測(ce)(ce)是(shi)非常經濟和高效的(de)(de)(de)。到目(mu)前為(wei)止(zhi)，Sanger 測(ce)(ce)序(xu)(xu)仍然是(shi)作為(wei)基(ji)(ji)因檢測(ce)(ce)的(de)(de)(de)金(jin)標準，也是(shi) NGS 基(ji)(ji)因檢測(ce)(ce)后進行家系(xi)內和正常對(dui)(dui)照組驗證(zheng)的(de)(de)(de)主要(yao)手段。
值(zhi)得注意(yi)的(de)(de)(de)(de)是，Sanger 測(ce)(ce)序(xu)目(mu)的(de)(de)(de)(de)是尋找與(yu)疾病(bing)有關的(de)(de)(de)(de)特定的(de)(de)(de)(de)基(ji)因(yin)突(tu)變(bian)。對(dui)(dui)于(yu)(yu)沒有明(ming)確(que)(que)候選(xuan)基(ji)因(yin)或候選(xuan)基(ji)因(yin)數量較多的(de)(de)(de)(de)大(da)樣本(ben)病(bing)例(li)篩查是難(nan)以(yi)完成的(de)(de)(de)(de)，此(ci)類測(ce)(ce)序(xu)研(yan)究(jiu)還要依(yi)靠具有高通量測(ce)(ce)序(xu)能(neng)力的(de)(de)(de)(de) NGS。雖然 Sanger 測(ce)(ce)序(xu)具有高度的(de)(de)(de)(de)分析準確(que)(que)性(xing)，但其準確(que)(que)性(xing)還取(qu)決于(yu)(yu)測(ce)(ce)序(xu)儀器以(yi)及測(ce)(ce)序(xu)條件的(de)(de)(de)(de)設定。另外，Sanger 測(ce)(ce)序(xu)不(bu)能(neng)檢測(ce)(ce)出大(da)片段缺失或拷(kao)貝數變(bian)異等基(ji)因(yin)突(tu)變(bian)的(de)(de)(de)(de)類型，因(yin)此(ci)對(dui)(dui)于(yu)(yu)一些(xie)與(yu)此(ci)相(xiang)關的(de)(de)(de)(de)遺傳性(xing)疾病(bing)還不(bu)能(neng)做出基(ji)因(yin)學診斷。
1.2 連鎖分析
采用(yong)的(de)(de)(de)是間(jian)(jian)(jian)接(jie)測(ce)序(xu)法(fa)。在(zai) NGS 出現(xian)(xian)(xian)(xian)之前，國際通(tong)用(yong)的(de)(de)(de)疾病(bing)基(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)(yin)(yin)定位(wei)(wei)(wei)(wei)克隆策(ce)略是建立在(zai)大(da)規模全基(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)(yin)(yin)掃描和連(lian)鎖(suo)(suo)分(fen)析基(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)礎上(shang)(shang)(shang)的(de)(de)(de)位(wei)(wei)(wei)(wei)置(zhi)候選(xuan)基(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)(yin)(yin)克隆。人(ren)(ren)類的(de)(de)(de)染(ran)色(se)體(ti)(ti)成對(dui)出現(xian)(xian)(xian)(xian)，一(yi)(yi)條(tiao)來自父親(qin)，一(yi)(yi)條(tiao)來自母(mu)親(qin)，每(mei)一(yi)(yi)對(dui)染(ran)色(se)體(ti)(ti)在(zai)同(tong)樣(yang)的(de)(de)(de)位(wei)(wei)(wei)(wei)置(zhi)上(shang)(shang)(shang)擁有相同(tong)的(de)(de)(de)基(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)(yin)(yin)，但是其序(xu)列并不完全相同(tong)，被稱(cheng)為(wei)父系(xi)(xi)(xi)和母(mu)系(xi)(xi)(xi)等位(wei)(wei)(wei)(wei)基(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)(yin)(yin)。遺(yi)傳(chuan)(chuan)(chuan)標記是指在(zai)人(ren)(ren)群(qun)中(zhong)表(biao)(biao)(biao)現(xian)(xian)(xian)(xian)出多態現(xian)(xian)(xian)(xian)象的(de)(de)(de) DNA 序(xu)列，可(ke)追蹤染(ran)色(se)體(ti)(ti)、染(ran)色(se)體(ti)(ti)某(mou)(mou)(mou)一(yi)(yi)節段或某(mou)(mou)(mou)個(ge)基(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)(yin)(yin)座在(zai)家(jia)系(xi)(xi)(xi)中(zhong)傳(chuan)(chuan)(chuan)遞的(de)(de)(de)任何一(yi)(yi)種(zhong)遺(yi)傳(chuan)(chuan)(chuan)特性(xing)(xing)(xing)。它存在(zai)于每(mei)一(yi)(yi)個(ge)人(ren)(ren)，但大(da)小和序(xu)列有差別(bie)，具有可(ke)遺(yi)傳(chuan)(chuan)(chuan)性(xing)(xing)(xing)和可(ke)識別(bie)性(xing)(xing)(xing)。目前采用(yong)第二(er)代(dai)遺(yi)傳(chuan)(chuan)(chuan)標記，即重復(fu)序(xu)列多態性(xing)(xing)(xing)，特別(bie)是短串(chuan)聯重復(fu)序(xu)列，又稱(cheng)微衛星標記。連(lian)鎖(suo)(suo)分(fen)析是以(yi)連(lian)鎖(suo)(suo)這(zhe)種(zhong)遺(yi)傳(chuan)(chuan)(chuan)現(xian)(xian)(xian)(xian)象為(wei)基(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)礎，研究致(zhi)病(bing)基(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)(yin)(yin)與(yu)(yu)遺(yi)傳(chuan)(chuan)(chuan)性(xing)(xing)(xing)標記之間(jian)(jian)(jian)關系(xi)(xi)(xi)的(de)(de)(de)方法(fa)。如果控制某(mou)(mou)(mou)一(yi)(yi)表(biao)(biao)(biao)型性(xing)(xing)(xing)狀的(de)(de)(de)基(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)(yin)(yin)附近存在(zai)遺(yi)傳(chuan)(chuan)(chuan)標記，那么利(li)用(yong)某(mou)(mou)(mou)個(ge)遺(yi)傳(chuan)(chuan)(chuan)標記與(yu)(yu)某(mou)(mou)(mou)個(ge)擬定位(wei)(wei)(wei)(wei)的(de)(de)(de)基(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)(yin)(yin)之間(jian)(jian)(jian)是否存在(zai)連(lian)鎖(suo)(suo)關系(xi)(xi)(xi)，以(yi)及連(lian)鎖(suo)(suo)的(de)(de)(de)緊密(mi)程度就能(neng)將該基(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)(yin)(yin)定位(wei)(wei)(wei)(wei)到染(ran)色(se)體(ti)(ti)某(mou)(mou)(mou)一(yi)(yi)位(wei)(wei)(wei)(wei)置(zhi)上(shang)(shang)(shang)。1986 年 Morton 等提(ti)出優勢對(dui)數記分(fen)法(fa)（og odds score method，LOD），主要檢測(ce)兩基(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)(yin)(yin)以(yi)某(mou)(mou)(mou)一(yi)(yi)重組率連(lian)鎖(suo)(suo)時(shi)的(de)(de)(de)似然性(xing)(xing)(xing)。LOD 值(zhi)為(wei)正，支持連(lian)鎖(suo)(suo)；LOD 值(zhi)為(wei)負，則否定連(lian)鎖(suo)(suo)。通(tong)過計算家(jia)系(xi)(xi)(xi)中(zhong)的(de)(de)(de)微衛星標記與(yu)(yu)致(zhi)病(bing)位(wei)(wei)(wei)(wei)點之間(jian)(jian)(jian)的(de)(de)(de) LOD 值(zhi)，可(ke)以(yi)初步估算二(er)者間(jian)(jian)(jian)的(de)(de)(de)遺(yi)傳(chuan)(chuan)(chuan)距(ju)離及連(lian)鎖(suo)(suo)程度，從而確(que)定該基(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)(yin)(yin)在(zai)染(ran)色(se)體(ti)(ti)上(shang)(shang)(shang)的(de)(de)(de)粗(cu)略位(wei)(wei)(wei)(wei)置(zhi)。然后利(li)用(yong)該區(qu)域的(de)(de)(de)染(ran)色(se)體(ti)(ti)基(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)(yin)(yin)圖譜，分(fen)析定位(wei)(wei)(wei)(wei)區(qu)域內所有基(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)(yin)(yin)的(de)(de)(de)功(gong)能(neng)與(yu)(yu)表(biao)(biao)(biao)達，選(xuan)擇(ze)合適的(de)(de)(de)候選(xuan)基(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)(yin)(yin)進行突變檢測(ce)，最終將致(zhi)病(bing)基(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)(yin)(yin)定位(wei)(wei)(wei)(wei)或克隆。
然而(er)，采(cai)(cai)用(yong)連鎖分(fen)析進(jin)行基因檢測存在(zai)很大的(de)局(ju)限性(xing)。不但所需(xu)遺傳樣本量較大，一(yi)般要求提供三(san)代及以上(shang)遺傳家(jia)系患(huan)者(zhe)血樣，而(er)且數據量大、處理復(fu)雜、產出速度較慢、定位(wei)(wei)不夠精確（一(yi)般只(zhi)能定位(wei)(wei)在(zai)染(ran)色體某一(yi)區間(jian)），這(zhe)就使得研究工(gong)作繁(fan)重(zhong)和(he)定位(wei)(wei)基因的(de)時間(jian)周期特別長。目前，連鎖分(fen)析采(cai)(cai)用(yong)的(de)單核苷酸多(duo)肽性(xing)和(he)短串(chuan)聯(lian)重(zhong)復(fu)序列還在(zai)使用(yong)，但經(jing)典(dian)的(de)間(jian)接測序方(fang)法，如單鏈(lian)構象多(duo)肽性(xing)、變(bian)性(xing)梯(ti)度凝膠(jiao)電泳和(he)異源雙鏈(lian)分(fen)析在(zai)美(mei)國已被淘(tao)汰，而(er)在(zai)發展中(zhong)國家(jia)作為研究手段還在(zai)有(you)限使用(yong)。
2、新一代測序（NGS）
主 要(yao) 包 括(kuo) 全 基 因 組 重(zhong) 測(ce)(ce)(ce) 序（whole-genomesequencing，WGS）、全外顯子組測(ce)(ce)(ce)序（whole-exomesequencing，WES）和(he)目(mu)標區域測(ce)(ce)(ce)序（Targeted regionssequencing，TRS），它們同屬于(yu)新(xin)一代測(ce)(ce)(ce)序技(ji)術。總體而言(yan)，NGS 技(ji)術具有通量大(da)、時間(jian)短(duan)、精(jing)確度高和(he)信息量豐(feng)富等優(you)點(dian)，使(shi)得遺傳學者可(ke)以在短(duan)時間(jian)內對感興(xing)趣的基因進(jin)行(xing)精(jing)確定(ding)位。但這些(xie)不同的測(ce)(ce)(ce)序技(ji)術在測(ce)(ce)(ce)序范(fan)圍、數據(ju)分析量以及(ji)測(ce)(ce)(ce)序費用(yong)和(he)時間(jian)等方面(mian)又有很大(da)差別，如(ru)果選(xuan)擇適合的方法(fa)，對于(yu)臨床(chuang)診斷和(he)科學研究將(jiang)起到事半功倍的作(zuo)用(yong)。
2.1 目標區域測序
目(mu)前常用的(de)是(shi)(shi)基(ji)(ji)因芯片(pian)技術(shu)。其(qi)測(ce)(ce)序(xu)(xu)原(yuan)理是(shi)(shi)基(ji)(ji)于(yu) DNA 雜(za)交(jiao)原(yuan)理，利(li)用目(mu)標(biao)基(ji)(ji)因組區域(yu)定(ding)制的(de)探(tan)針(zhen)與基(ji)(ji)因組 DNA 進行(xing)芯片(pian)雜(za)交(jiao)或溶液雜(za)交(jiao)，將目(mu)標(biao)基(ji)(ji)因區域(yu) DNA 富集(ji)，再(zai)通(tong)(tong)過NGS 技術(shu)進行(xing)測(ce)(ce)序(xu)(xu)。其(qi)測(ce)(ce)序(xu)(xu)過程(cheng)是(shi)(shi)通(tong)(tong)過把(ba)數以萬計的(de) cDNA 或寡聚核(he)苷(gan)(gan)酸置于(yu)芯片(pian)上制成(cheng)(cheng)列陣，將芯片(pian)上固定(ding)好的(de)已知序(xu)(xu)列的(de)核(he)苷(gan)(gan)酸探(tan)針(zhen)與溶液中含有(you)熒光標(biao)記的(de)相(xiang)應(ying)核(he)酸序(xu)(xu)列進行(xing)互補(bu)配對(dui)，根(gen)據(ju)測(ce)(ce)序(xu)(xu)儀所顯(xian)示強熒光的(de)位(wei)置和強度，獲(huo)取每(mei)組點陣列信(xin)息(xi)(xi)，再(zai)利(li)用生物信(xin)息(xi)(xi)學(xue)算法確定(ding)目(mu)的(de)靶核(he)苷(gan)(gan)酸的(de)序(xu)(xu)列組成(cheng)(cheng)。測(ce)(ce)序(xu)(xu)所選定(ding)的(de)目(mu)標(biao)區域(yu)可以是(shi)(shi)連(lian)續(xu)的(de) DNA 序(xu)(xu)列，也可以是(shi)(shi)分布在(zai)同(tong)一(yi)(yi)個(ge)染色(se)體(ti)不同(tong)區域(yu)或不同(tong)染色(se)體(ti)上的(de)片(pian)段。目(mu)標(biao)區域(yu)測(ce)(ce)序(xu)(xu)技術(shu)，對(dui)于(yu)以往通(tong)(tong)過連(lian)鎖(suo)分析將基(ji)(ji)因突(tu)變鎖(suo)定(ding)在(zai)染色(se)體(ti)某一(yi)(yi)片(pian)段區域(yu)內，但(dan)無法找出(chu)突(tu)變是(shi)(shi)一(yi)(yi)個(ge)非常好的(de)進一(yi)(yi)步檢測(ce)(ce)手段。2010 年，Nicholas等(deng)使用基(ji)(ji)因分型芯片(pian)聯(lian)合連(lian)鎖(suo)分析技術(shu)，成(cheng)(cheng)功發現頭小畸形的(de)新基(ji)(ji)因 WDR62，文(wen)章發表(biao)在(zai)《NatGenet》雜(za)志。類似的(de)研究在(zai)家(jia)族性胰(yi)腺癌中確定(ding) 8 個(ge)候選變異位(wei)點和在(zai)家(jia)族性滲出(chu)性玻璃體(ti)視(shi)網(wang)膜病變發現易(yi)感基(ji)(ji)因 TSPAN12。
基(ji)(ji)因(yin)(yin)芯(xin)片測序(xu)技術(shu)可(ke)以將經過連(lian)鎖分(fen)析(xi)鎖定了(le)(le)目標范圍(wei)(wei)或經過全基(ji)(ji)因(yin)(yin)組篩(shai)選的特定基(ji)(ji)因(yin)(yin)或區域進行更深(shen)一層的研究，是(shi)解決(jue)連(lian)鎖分(fen)析(xi)無法發現(xian)致病基(ji)(ji)因(yin)(yin)的有(you)效手段。基(ji)(ji)因(yin)(yin)芯(xin)片技術(shu)對于(yu)(yu)已知(zhi)基(ji)(ji)因(yin)(yin)突(tu)變的篩(shai)查具有(you)明(ming)顯(xian)優勢(shi)，可(ke)以快速(su)、全面地檢測出目標基(ji)(ji)因(yin)(yin)突(tu)變。同時，由(you)(you)于(yu)(yu)目標區域受到了(le)(le)限(xian)制，測序(xu)范圍(wei)(wei)大(da)幅度減少，測序(xu)時間和費用(yong)相應降低。但基(ji)(ji)因(yin)(yin)芯(xin)片檢測所需要的 DNA 的量要大(da)，由(you)(you)于(yu)(yu)已提取(qu)的 DNA 存在降解的風險(xian)，用(yong)于(yu)(yu)基(ji)(ji)因(yin)(yin)芯(xin)片研究的血標本最(zui)好是(shi)冰凍的全血，這樣可(ke)以使用(yong)于(yu)(yu)檢測 DNA 的量有(you)充分(fen)保證。
2.2 全外顯子組測序 （WES）
外(wai)顯子(zi)組(zu)是(shi)單(dan)個個體(ti)的(de)(de)(de)基(ji)(ji)因(yin)組(zu) DNA 上所有(you)(you)蛋白質編碼(ma)序(xu)列的(de)(de)(de)總合。人類(lei)外(wai)顯子(zi)組(zu)序(xu)列約占人類(lei)全部基(ji)(ji)因(yin)組(zu)序(xu)列的(de)(de)(de) 1%，但大約包含 85% 的(de)(de)(de)致病(bing)突變。WES 是(shi)利(li)用序(xu)列捕獲(huo)技(ji)術將全外(wai)顯子(zi)區(qu)域(yu) DNA 捕捉(zhuo)并富(fu)集后(hou)進行高通量測(ce)(ce)序(xu)的(de)(de)(de)基(ji)(ji)因(yin)分析方法。采用的(de)(de)(de)技(ji)術平臺(tai)主(zhu)要(yao)是(shi)羅氏公司的(de)(de)(de) SeqCap EZ 全外(wai)顯子(zi)捕獲(huo)系統(tong)，Illumina 公司的(de)(de)(de) Solexa 技(ji)術和(he)(he) Agilent 公司的(de)(de)(de) SureSelect 外(wai)顯子(zi)靶(ba)向序(xu)列富(fu)集系統(tong)。其捕獲(huo)的(de)(de)(de)目(mu)標(biao)區(qu)在 34 ~ 62 M 之間(jian)，不(bu)僅包括編碼(ma)區(qu)同(tong)時也(ye)加(jia)入了(le)部分非(fei)編碼(ma)區(qu)。NGS 的(de)(de)(de)測(ce)(ce)序(xu)過程(cheng)主(zhu)要(yao)包括DNA 測(ce)(ce)序(xu)文庫(ku)(ku)的(de)(de)(de)制備、錨(mao)定橋(qiao)接、PCR 擴增、單(dan)堿基(ji)(ji)延伸測(ce)(ce)序(xu)和(he)(he)數(shu)(shu)據分析。研究者根(gen)據測(ce)(ce)序(xu)儀捕獲(huo)到(dao)在測(ce)(ce)序(xu)過程(cheng)中摻入有(you)(you)不(bu)同(tong)熒光(guang)標(biao)記(ji)堿基(ji)(ji)片(pian)段，經(jing)計算機將熒光(guang)信號(hao)轉化成不(bu)同(tong)顏色的(de)(de)(de)測(ce)(ce)序(xu)峰圖和(he)(he)堿基(ji)(ji)序(xu)列。基(ji)(ji)因(yin)測(ce)(ce)序(xu)結果與NCBI的(de)(de)(de)SNP數(shu)(shu)據庫(ku)(ku)、千人基(ji)(ji)因(yin)組(zu)數(shu)(shu)據庫(ku)(ku)等國際權威數(shu)(shu)據庫(ku)(ku)比對，最終確(que)定是(shi)否為(wei)突變基(ji)(ji)因(yin)。
自NGS 技術問世以來(lai)，利用 WES 在(zai)臨床疾病(bing)致病(bing)基(ji)(ji)(ji)因的(de)鑒定研(yan)(yan)究中取得前所(suo)未有的(de)成(cheng)果。這些(xie)成(cheng)果不僅(jin)集中在(zai)單基(ji)(ji)(ji)因遺傳疾病(bing)，還在(zai)多基(ji)(ji)(ji)因影響的(de)復雜(za)(za)疾病(bing)中獲得大量相關(guan)基(ji)(ji)(ji)因的(de)發(fa)現(xian)。在(zai)單基(ji)(ji)(ji)因遺傳性(xing)疾病(bing)中，如(ru)視網(wang)膜(mo)色素變性(xing)、終(zhong)端骨(gu)發(fa)育不良(liang)(liang)等(deng)(deng)(deng)發(fa)現(xian)新基(ji)(ji)(ji)因或已知基(ji)(ji)(ji)因新突變。在(zai)一(yi)些(xie)罕(han)見的(de)疾病(bing)中，如(ru) Kabuki 綜(zong)合征、家族性(xing)混合型低脂血(xue)癥和脊髓小腦共濟(ji)失調癥等(deng)(deng)(deng)疾病(bing)中發(fa)現(xian)新的(de)致病(bing)基(ji)(ji)(ji)因。同時，在(zai)小細胞(bao)肺癌、慢性(xing)淋巴細胞(bao)性(xing)白血(xue)病(bing)等(deng)(deng)(deng)腫(zhong)瘤研(yan)(yan)究和諸如(ru)肥(fei)胖癥、腦皮質發(fa)育不良(liang)(liang)等(deng)(deng)(deng)復雜(za)(za)疾病(bing)的(de)研(yan)(yan)究中也取得豐碩成(cheng)果。
WES 技(ji)術(shu)在(zai)篩(shai)查(cha)范圍和檢(jian)出率(lv)等(deng)方面(mian)較(jiao)其他測(ce)(ce)序(xu)技(ji)術(shu)具有明顯的(de)(de)(de)(de)優(you)勢(shi)。例如(ru)，對于采用 Sanger測(ce)(ce)序(xu)和基(ji)(ji)因(yin)芯片測(ce)(ce)序(xu)不(bu)(bu)能(neng)篩(shai)查(cha)出基(ji)(ji)因(yin)的(de)(de)(de)(de)樣本，可(ke)(ke)(ke)以(yi)采用 WES 來進(jin)一步基(ji)(ji)因(yin)篩(shai)查(cha)鑒定(ding)。應用 WES技(ji)術(shu)能(neng)夠獲得較(jiao)傳統(tong) Sanger 等(deng)方法對編(bian)(bian)碼區測(ce)(ce)序(xu)更(geng)深的(de)(de)(de)(de)覆蓋度(du)和更(geng)準(zhun)確的(de)(de)(de)(de)數據。由(you)于信息(xi)(xi)量(liang)的(de)(de)(de)(de)大(da)幅度(du)增加，WES 可(ke)(ke)(ke)以(yi)獲得更(geng)多個(ge)(ge)體(ti)的(de)(de)(de)(de)編(bian)(bian)碼區信息(xi)(xi)，因(yin)此成為檢(jian)測(ce)(ce)致病(bing)基(ji)(ji)因(yin)和易感(gan)基(ji)(ji)因(yin)位(wei)點的(de)(de)(de)(de)有效手段。與連鎖分析定(ding)位(wei)方法比較(jiao)，WES 對家(jia)(jia)系(xi)的(de)(de)(de)(de)要(yao)求并不(bu)(bu)十分嚴格(ge)，在(zai)單(dan)基(ji)(ji)因(yin)遺(yi)傳病(bing)同一家(jia)(jia)系(xi)中有 2 ~3 個(ge)(ge)患者和 1 個(ge)(ge)正常人即可(ke)(ke)(ke)進(jin)行(xing)致病(bing)基(ji)(ji)因(yin)的(de)(de)(de)(de)鑒定(ding)研(yan)究，而不(bu)(bu)需(xu)(xu)要(yao)連續三(san)代(dai)的(de)(de)(de)(de)遺(yi)傳家(jia)(jia)系(xi)。由(you)于不(bu)(bu)需(xu)(xu)要(yao)嚴格(ge)的(de)(de)(de)(de)三(san)代(dai)以(yi)上(shang)的(de)(de)(de)(de)遺(yi)傳家(jia)(jia)系(xi)，WES 使以(yi)前不(bu)(bu)能(neng)進(jin)行(xing)研(yan)究的(de)(de)(de)(de)家(jia)(jia)系(xi)成為可(ke)(ke)(ke)能(neng)。不(bu)(bu)僅對于單(dan)基(ji)(ji)因(yin)遺(yi)傳病(bing)是一個(ge)(ge)很好的(de)(de)(de)(de)研(yan)究手段，對于許多常見(jian)病(bing)，如(ru)腫瘤、糖(tang)尿病(bing)等(deng)疾(ji)病(bing)也可(ke)(ke)(ke)進(jin)行(xing)大(da)規模比較(jiao)研(yan)究。
2.3 全基因組重測序 （WGS）
WGS 是對已知基因組序列的物種進行不同個體的全基因組的測序，經過數據分析后對序列進行拼接、組裝并獲得基因組圖譜，或是對不同組織進行測序并分析體細胞突變的一種研究方法。盡管 WES 可以快速全面地找出個體基因組上的所有突變，從而找到個體間的差異，但對于外顯子以外的區域則不能有效地進行基因檢測。對于此種情況，目前還要借助WGS 進行全基因組檢測。但由于人類基因組過于龐大，一次單端全基因組測序很難達到所需要的測序深度。因此，需要重復測序或雙端測序，由此帶來測序成本的大幅度提高和由于不能達到足夠的測序深度所導致的結果準確性的降低。而對于臨床疾病診斷和普通科研工作，其高昂的檢測費用也是難以承受的。盡管如此，對于部分臨床研究和 WES 不能解決的科研課題還需要借助 WGS進行更加全面的基因檢測。
