【基因測(ce)序是什么(me)】基因測(ce)序有什么(me)用 基因測(ce)序原理技術
隨著基因測(ce)序(xu)技術的發(fa)(fa)展和費用的降低，現在普通人(ren)也可(ke)(ke)以在可(ke)(ke)承(cheng)受的經(jing)濟范圍內進行(xing)個(ge)體測(ce)序(xu)分(fen)析(xi)，測(ce)序(xu)技術成(cheng)為精(jing)準(zhun)醫學發(fa)(fa)展和個(ge)體化治療中一(yi)個(ge)非常重(zhong)要的工(gong)具(ju)，我們(men)即將迎來一(yi)個(ge)全民測(ce)序(xu)的時代。而(er)這樣一(yi)種強大的工(gong)具(ju)在科學家們(men)的手中又可(ke)(ke)以發(fa)(fa)揮(hui)出更大價值，挖掘出更有深度的信息。基因測(ce)序(xu)技術在精(jing)準(zhun)醫學中得到(dao)了哪些(xie)應(ying)用呢？小編從以下(xia)幾個(ge)方面結(jie)合已發(fa)(fa)表(biao)文章進行(xing)了總結(jie)。
基因測序助力癌癥研究尋找治療靶點
在(zai)2016年4月8日那期Science期刊上，美(mei)國布羅德研(yan)究(jiu)(jiu)所Aviv Regev的(de)(de)(de)領導(dao)的(de)(de)(de)癌癥研(yan)究(jiu)(jiu)團隊通(tong)過與麻省理工學(xue)院副教(jiao)授、單細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)分析先(xian)鋒Alex Shalek合作，利用(yong)單細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)RNA-seq方法每(mei)次一(yi)個細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)地研(yan)究(jiu)(jiu)整個腫瘤(liu)(liu)(liu)以便確定哪些(xie)類(lei)型的(de)(de)(de)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)存(cun)在(zai)于(yu)腫瘤(liu)(liu)(liu)中。他們不僅分析了(le)惡性(xing)腫瘤(liu)(liu)(liu)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)，而且(qie)也分析了(le)腫瘤(liu)(liu)(liu)內所有不同(tong)類(lei)型的(de)(de)(de)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)。這是首次開展這樣(yang)的(de)(de)(de)研(yan)究(jiu)(jiu)。如(ru)(ru)今，他們知道每(mei)種腫瘤(liu)(liu)(liu)的(de)(de)(de)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)組成(cheng)，也知道每(mei)種類(lei)型的(de)(de)(de)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)的(de)(de)(de)基因表達模式，這樣(yang)就能夠(gou)回(hui)個頭去重(zhong)新(xin)分析一(yi)些(xie)大體積腫瘤(liu)(liu)(liu)測序(xu)數據（比(bi)如(ru)(ru)，癌癥基因組圖譜）以便從現存(cun)的(de)(de)(de)數據中找出(chu)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)如(ru)(ru)何(he)相互作用(yong)和一(yi)定程度上利用(yong)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)重(zhong)建大塊腫瘤(liu)(liu)(liu)樣(yang)品(pin)的(de)(de)(de)整體行為。
在一篇發表(biao)在國際學術(shu)期刊(kan)Nature Communication上的(de)文章(zhang)中，來自美國的(de)科學家(jia)們對109名胰腺導管腺癌（PDA）病人進行了全外(wai)顯子測序，發現(xian)了PDA中的(de)基因突變(bian)多樣性，并且為發現(xian)PDA治療靶點提供(gong)了重要信息。
在(zai)該項研究中(zhong)，研究人員為方(fang)便檢(jian)(jian)測基因突變，同時移除非腫瘤性組(zu)織的(de)污(wu)染，他們利用顯微(wei)(wei)切割的(de)方(fang)法將(jiang)癌癥患(huan)者的(de)腫瘤組(zu)織進行了(le)異種移植(zhi)并(bing)(bing)建立了(le)細胞(bao)系。隨后對109例進行過(guo)顯微(wei)(wei)切割的(de)PDA病例進行了(le)全外顯子測序，經過(guo)顯微(wei)(wei)切割操作(zuo)后，腫瘤細胞(bao)得到(dao)富集并(bing)(bing)增強(qiang)了(le)對基因突變的(de)檢(jian)(jian)測。研究人員通過(guo)分(fen)析發現導致(zhi)PDA發生的(de)病因事件(jian)與腫瘤突變譜具有明顯相關性。
基因測序幫助尋找生物標記物 助力疾病診斷
在(zai)歐(ou)洲泌(mi)尿外(wai)科(ke)協(xie)會的(de)研究(jiu)者(zhe)公布的(de)一項最(zui)新(xin)研究(jiu)成果中，研究(jiu)者(zhe)對(dui)64份前列腺組織樣(yang)本進行(xing)研究(jiu)，對(dui)每一種樣(yang)本中的(de)2億(yi)個序(xu)列進行(xing)閱讀分析，結果研究(jiu)者(zhe)發現(xian)在(zai)腫瘤和(he)控(kong)制(zhi)樣(yang)本中有(you)超(chao)過2000個基因都表現(xian)出(chu)了明顯(xian)的(de)差異性(xing)，其中有(you)些(xie)相比(bi)已知的(de)前列腺癌(ai)(ai)標志物而(er)言(yan)表現(xian)出(chu)了較高的(de)特異性(xing)和(he)敏感性(xing);其中一種名為TAPIR的(de)非編碼RNAs則可(ke)以(yi)有(you)效抑(yi)制(zhi)癌(ai)(ai)細(xi)胞的(de)生(sheng)長，盡管其可(ke)以(yi)轉化為臨床有(you)用的(de)治(zhi)療靶點還為時尚早(zao)。
研(yan)究者(zhe)在(zai)前列(lie)腺癌患者(zhe)的尿液(ye)中(zhong)發現了這些生物(wu)(wu)標志物(wu)(wu)，檢測結(jie)果顯示其可以幫(bang)助進行準確(que)的前列(lie)腺癌檢測，基于(yu)相關研(yan)究結(jie)果，研(yan)究人員決定開發一(yi)種(zhong)進行前列(lie)腺癌早期診斷(duan)的高(gao)特異性及敏(min)感性的，且基于(yu)尿液(ye)的檢測手段;這種(zhong)檢測方(fang)法(fa)基于(yu)對多(duo)個生物(wu)(wu)標志物(wu)(wu)的組合，相比單一(yi)標志物(wu)(wu)而言(yan)將(jiang)表(biao)現出較高(gao)的特異性。
基因測序幫助監測全球性疾病暴發
在一篇發表于Nature雜志上的(de)報道中，來(lai)(lai)自伯明(ming)翰(han)大學的(de)研究人(ren)員解釋了如何利(li)用(yong)基因組測(ce)序(xu)的(de)技術來(lai)(lai)快速實(shi)現對(dui)疾病(bing)(bing)暴(bao)發的(de)有效監(jian)測(ce);文(wen)章中他(ta)們開發了一種手(shou)提箱(xiang)式的(de)基因組測(ce)序(xu)“實(shi)驗室”，其(qi)中包含有一種新型的(de)DNA測(ce)序(xu)儀，最(zui)初該設備用(yong)于2015年4月在幾內亞(ya)對(dui)埃(ai)博拉病(bing)(bing)人(ren)的(de)樣(yang)本進行檢測(ce)。
這項(xiang)研究(jiu)中(zhong)，研究(jiu)人員利(li)用這種便(bian)攜式的(de)DNA測(ce)序儀(yi)在整個基(ji)因組庫(ku)中(zhong)鑒別(bie)出(chu)了新型的(de)單核苷酸多態性（SNPs），目(mu)前(qian)當測(ce)序工作(zuo)局限于實(shi)驗室的(de)時候，這種便(bian)攜式機器(qi)的(de)開發對于有效進行疾(ji)病暴發的(de)監(jian)測(ce)而言非常重要，研究(jiu)者們還希(xi)望可以(yi)將這種便(bian)攜式的(de)機器(qi)應用于別(bie)的(de)領域的(de)研究(jiu)中(zhong)，比(bi)如癌(ai)癥研究(jiu)等。
在(zai)另外一項(xiang)研(yan)究(jiu)中(zhong)，來自英國牛津大學和巴(ba)西Evandro Chagas研(yan)究(jiu)所等機(ji)構的研(yan)究(jiu)人員對巴(ba)西的寨卡病毒暴發進行首個基因組分(fen)析，從(cong)而提供關(guan)于這種病毒如(ru)何(he)和何(he)時(shi)可(ke)能(neng)進入美洲方面的新(xin)信(xin)息。
研究人員對7株巴西寨卡病毒毒株的基因組進行測序，包括一株毒株來自一例致命的成年人病例和另一株毒株來自一名頭小畸型新生兒。
1、第一代測序
1.1 Sanger 測序
采用的(de)(de)是直(zhi)接(jie)測(ce)序(xu)法。1977年(nian)，Frederick Sanger 等發明了雙脫(tuo)氧鏈末端(duan)終止法，這一技術(shu)隨后成(cheng)為(wei)最為(wei)常(chang)用的(de)(de)基(ji)(ji)因測(ce)序(xu)技術(shu)。2001 年(nian)，Allan Maxam 和 Walter Gibert 發 明了 Sanger 測(ce)序(xu)法，并在此后的(de)(de) 10 年(nian)里成(cheng)為(wei)基(ji)(ji)因檢測(ce)的(de)(de)金標(biao)準(zhun)。其基(ji)(ji)本原(yuan)理即雙脫(tuo)氧核苷三磷酸（dideoxyribonucleoside triphosphate，ddNTP）缺(que)乏PCR 延伸所需的(de)(de) 3'-OH，因此每當 DNA 鏈加入分子 ddNTP，延伸便終止。每一次 DNA 測(ce)序(xu)是由 4個獨立的(de)(de)反(fan)應組成(cheng)，將模板(ban)、引物和 4 種含有不同的(de)(de)放射性同位(wei)(wei)素標(biao)記的(de)(de)核苷酸的(de)(de) ddNTP 分別與DNA 聚合酶混合形成(cheng)長短(duan)不一的(de)(de)片段，大(da)量起(qi)始(shi)點相同、終止點不同的(de)(de) DNA 片段存在于反(fan)應體系中(zhong)，具有單個堿(jian)基(ji)(ji)差別的(de)(de) DNA 序(xu)列(lie)可以被聚丙烯酰胺變(bian)性凝膠(jiao)電(dian)泳分離出來，得到放射性同位(wei)(wei)素自顯影條帶(dai)。依據電(dian)泳條帶(dai)讀取 DNA 雙鏈的(de)(de)堿(jian)基(ji)(ji)序(xu)列(lie)。
人類基(ji)(ji)因組的(de)測(ce)(ce)序正是(shi)(shi)基(ji)(ji)于(yu)該技術完成的(de)。Sanger 測(ce)(ce)序這種直接(jie)測(ce)(ce)序方法具(ju)有高度的(de)準確性和(he)簡(jian)單(dan)、快捷(jie)等(deng)特點(dian)(dian)。目(mu)前，依然對于(yu)一(yi)些臨床上小樣本遺(yi)傳(chuan)疾病基(ji)(ji)因的(de)鑒定具(ju)有很高的(de)實(shi)用(yong)價值(zhi)。例如，臨床上采用(yong) Sanger 直接(jie)測(ce)(ce)序 FGFR 2 基(ji)(ji)因證實(shi)單(dan)基(ji)(ji)因 Apert 綜合征和(he)直接(jie)測(ce)(ce)序 TCOF1 基(ji)(ji)因可以檢出多達(da) 90% 的(de)與 Treacher Collins 綜合征相關的(de)突(tu)變。值(zhi)得(de)注(zhu)意的(de)是(shi)(shi)，Sanger 測(ce)(ce)序是(shi)(shi)針對已知致病基(ji)(ji)因的(de)突(tu)變位點(dian)(dian)設計引物，進行 PCR 直接(jie)擴增(zeng)(zeng)測(ce)(ce)序。單(dan)個突(tu)變點(dian)(dian)的(de)擴增(zeng)(zeng)包括該位點(dian)(dian)在內的(de)外顯子(zi)片(pian)段即(ji)可，不必將該點(dian)(dian)所(suo)在基(ji)(ji)因的(de)全部外顯子(zi)都擴增(zeng)(zeng)。
因(yin)此，應明確定位要擴增的(de)位點所在(zai)的(de)基(ji)因(yin)外顯(xian)子(zi)和該點的(de)具體位置(zhi)，設計包(bao)括(kuo)該點在(zai)內(nei)的(de)上下游 150 ~ 200 bp 的(de)外顯(xian)子(zi)片段引物。此外，盡管有(you)(you)NGS 的(de)出現，但 Sanger 測序(xu)(xu)對于有(you)(you)致病(bing)基(ji)因(yin)位點明確并且數量(liang)有(you)(you)限的(de)單(dan)基(ji)因(yin)遺傳(chuan)疾病(bing)的(de)致病(bing)基(ji)因(yin)的(de)檢(jian)測是非常經(jing)濟和高效的(de)。到目前為止，Sanger 測序(xu)(xu)仍然(ran)是作為基(ji)因(yin)檢(jian)測的(de)金標準，也是 NGS 基(ji)因(yin)檢(jian)測后進行家系內(nei)和正常對照組驗證的(de)主(zhu)要手段。
值得注意的(de)(de)是，Sanger 測(ce)序(xu)(xu)目(mu)的(de)(de)是尋(xun)找與(yu)疾(ji)病(bing)(bing)有關(guan)的(de)(de)特定(ding)的(de)(de)基(ji)(ji)因(yin)突變(bian)。對于沒有明確(que)候選基(ji)(ji)因(yin)或(huo)候選基(ji)(ji)因(yin)數(shu)(shu)量較多的(de)(de)大樣本(ben)病(bing)(bing)例篩查是難(nan)以(yi)完成的(de)(de)，此類(lei)測(ce)序(xu)(xu)研究還(huan)(huan)要依靠具有高通量測(ce)序(xu)(xu)能力的(de)(de) NGS。雖然 Sanger 測(ce)序(xu)(xu)具有高度的(de)(de)分析(xi)準確(que)性，但(dan)其準確(que)性還(huan)(huan)取決于測(ce)序(xu)(xu)儀器以(yi)及測(ce)序(xu)(xu)條件的(de)(de)設定(ding)。另外，Sanger 測(ce)序(xu)(xu)不(bu)能檢測(ce)出大片段缺失或(huo)拷貝數(shu)(shu)變(bian)異等(deng)基(ji)(ji)因(yin)突變(bian)的(de)(de)類(lei)型，因(yin)此對于一些(xie)與(yu)此相關(guan)的(de)(de)遺傳性疾(ji)病(bing)(bing)還(huan)(huan)不(bu)能做出基(ji)(ji)因(yin)學診(zhen)斷(duan)。
1.2 連鎖分析
采用的(de)(de)(de)(de)(de)(de)是間接測序(xu)(xu)法。在(zai)(zai)(zai) NGS 出現(xian)(xian)之前(qian)，國際(ji)通用的(de)(de)(de)(de)(de)(de)疾病基(ji)(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)定(ding)(ding)位(wei)克(ke)隆策略是建(jian)立在(zai)(zai)(zai)大規模全(quan)基(ji)(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)掃描和連(lian)(lian)(lian)(lian)鎖(suo)(suo)分析(xi)基(ji)(ji)(ji)(ji)礎上的(de)(de)(de)(de)(de)(de)位(wei)置候選基(ji)(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)克(ke)隆。人(ren)類的(de)(de)(de)(de)(de)(de)染(ran)(ran)色(se)(se)(se)(se)體(ti)成對出現(xian)(xian)，一(yi)(yi)(yi)條來(lai)自父親，一(yi)(yi)(yi)條來(lai)自母(mu)親，每一(yi)(yi)(yi)對染(ran)(ran)色(se)(se)(se)(se)體(ti)在(zai)(zai)(zai)同樣的(de)(de)(de)(de)(de)(de)位(wei)置上擁有相同的(de)(de)(de)(de)(de)(de)基(ji)(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)，但是其序(xu)(xu)列(lie)并不(bu)完全(quan)相同，被稱為(wei)父系和母(mu)系等位(wei)基(ji)(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)。遺(yi)(yi)傳(chuan)(chuan)標(biao)(biao)(biao)記是指在(zai)(zai)(zai)人(ren)群中(zhong)(zhong)表(biao)現(xian)(xian)出多態(tai)現(xian)(xian)象(xiang)的(de)(de)(de)(de)(de)(de) DNA 序(xu)(xu)列(lie)，可追蹤染(ran)(ran)色(se)(se)(se)(se)體(ti)、染(ran)(ran)色(se)(se)(se)(se)體(ti)某一(yi)(yi)(yi)節段或(huo)某個基(ji)(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)座在(zai)(zai)(zai)家系中(zhong)(zhong)傳(chuan)(chuan)遞的(de)(de)(de)(de)(de)(de)任何(he)一(yi)(yi)(yi)種(zhong)遺(yi)(yi)傳(chuan)(chuan)特性。它存在(zai)(zai)(zai)于每一(yi)(yi)(yi)個人(ren)，但大小(xiao)和序(xu)(xu)列(lie)有差別，具有可遺(yi)(yi)傳(chuan)(chuan)性和可識別性。目前(qian)采用第(di)二代遺(yi)(yi)傳(chuan)(chuan)標(biao)(biao)(biao)記，即重(zhong)復序(xu)(xu)列(lie)多態(tai)性，特別是短串聯重(zhong)復序(xu)(xu)列(lie)，又稱微(wei)衛星標(biao)(biao)(biao)記。連(lian)(lian)(lian)(lian)鎖(suo)(suo)分析(xi)是以(yi)(yi)連(lian)(lian)(lian)(lian)鎖(suo)(suo)這(zhe)種(zhong)遺(yi)(yi)傳(chuan)(chuan)現(xian)(xian)象(xiang)為(wei)基(ji)(ji)(ji)(ji)礎，研(yan)究(jiu)致(zhi)病基(ji)(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)與(yu)(yu)遺(yi)(yi)傳(chuan)(chuan)性標(biao)(biao)(biao)記之間關系的(de)(de)(de)(de)(de)(de)方(fang)法。如(ru)果控制(zhi)某一(yi)(yi)(yi)表(biao)型性狀的(de)(de)(de)(de)(de)(de)基(ji)(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)附近存在(zai)(zai)(zai)遺(yi)(yi)傳(chuan)(chuan)標(biao)(biao)(biao)記，那么利(li)用某個遺(yi)(yi)傳(chuan)(chuan)標(biao)(biao)(biao)記與(yu)(yu)某個擬定(ding)(ding)位(wei)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)基(ji)(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)之間是否存在(zai)(zai)(zai)連(lian)(lian)(lian)(lian)鎖(suo)(suo)關系，以(yi)(yi)及連(lian)(lian)(lian)(lian)鎖(suo)(suo)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)緊密(mi)程(cheng)(cheng)度就能(neng)將(jiang)該基(ji)(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)定(ding)(ding)位(wei)到染(ran)(ran)色(se)(se)(se)(se)體(ti)某一(yi)(yi)(yi)位(wei)置上。1986 年 Morton 等提(ti)出優勢對數記分法（og odds score method，LOD），主要檢(jian)測兩基(ji)(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)以(yi)(yi)某一(yi)(yi)(yi)重(zhong)組率連(lian)(lian)(lian)(lian)鎖(suo)(suo)時(shi)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)似然(ran)性。LOD 值為(wei)正，支持連(lian)(lian)(lian)(lian)鎖(suo)(suo)；LOD 值為(wei)負，則否定(ding)(ding)連(lian)(lian)(lian)(lian)鎖(suo)(suo)。通過計算家系中(zhong)(zhong)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)微(wei)衛星標(biao)(biao)(biao)記與(yu)(yu)致(zhi)病位(wei)點之間的(de)(de)(de)(de)(de)(de) LOD 值，可以(yi)(yi)初步估算二者間的(de)(de)(de)(de)(de)(de)遺(yi)(yi)傳(chuan)(chuan)距離及連(lian)(lian)(lian)(lian)鎖(suo)(suo)程(cheng)(cheng)度，從而確定(ding)(ding)該基(ji)(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)在(zai)(zai)(zai)染(ran)(ran)色(se)(se)(se)(se)體(ti)上的(de)(de)(de)(de)(de)(de)粗略位(wei)置。然(ran)后利(li)用該區域(yu)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)染(ran)(ran)色(se)(se)(se)(se)體(ti)基(ji)(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)圖譜，分析(xi)定(ding)(ding)位(wei)區域(yu)內(nei)所(suo)有基(ji)(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)功能(neng)與(yu)(yu)表(biao)達，選擇合適的(de)(de)(de)(de)(de)(de)候選基(ji)(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)進行突變(bian)檢(jian)測，最(zui)終將(jiang)致(zhi)病基(ji)(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)定(ding)(ding)位(wei)或(huo)克(ke)隆。
然而(er)，采用(yong)連(lian)(lian)鎖(suo)分析(xi)進行基(ji)因檢測存在很大的局限(xian)性(xing)。不(bu)但所需遺傳(chuan)樣本量(liang)較大，一般要(yao)求提(ti)供(gong)三代及以上遺傳(chuan)家(jia)系患者(zhe)血(xue)樣，而(er)且數(shu)據(ju)量(liang)大、處理復雜(za)、產出速度較慢、定位不(bu)夠精確（一般只能定位在染色體某(mou)一區間），這就使(shi)得研究工作繁重和定位基(ji)因的時間周(zhou)期特別長。目前，連(lian)(lian)鎖(suo)分析(xi)采用(yong)的單核苷(gan)酸多肽(tai)性(xing)和短串(chuan)聯重復序列(lie)還(huan)在使(shi)用(yong)，但經典的間接測序方法，如(ru)單鏈(lian)構象(xiang)多肽(tai)性(xing)、變性(xing)梯度凝膠電泳和異源雙鏈(lian)分析(xi)在美國已被淘汰，而(er)在發(fa)展中國家(jia)作為研究手(shou)段還(huan)在有(you)限(xian)使(shi)用(yong)。
2、新一代測序（NGS）
主 要 包 括 全 基 因 組(zu) 重 測(ce)(ce) 序(xu)(xu)（whole-genomesequencing，WGS）、全外顯子組(zu)測(ce)(ce)序(xu)(xu)（whole-exomesequencing，WES）和目標區域測(ce)(ce)序(xu)(xu)（Targeted regionssequencing，TRS），它(ta)們(men)同屬(shu)于(yu)新(xin)一代測(ce)(ce)序(xu)(xu)技(ji)術(shu)。總體而言，NGS 技(ji)術(shu)具有通量大、時間(jian)短、精確度(du)高和信息量豐富(fu)等(deng)優(you)點，使(shi)得(de)遺傳學者可以在(zai)短時間(jian)內對(dui)感興趣的(de)基因進行精確定(ding)位。但這(zhe)些(xie)不(bu)同的(de)測(ce)(ce)序(xu)(xu)技(ji)術(shu)在(zai)測(ce)(ce)序(xu)(xu)范圍、數據分析量以及測(ce)(ce)序(xu)(xu)費用(yong)和時間(jian)等(deng)方(fang)面(mian)又有很大差別，如果選擇適(shi)合的(de)方(fang)法，對(dui)于(yu)臨床診斷(duan)和科學研究(jiu)將起(qi)到事半(ban)功倍的(de)作(zuo)用(yong)。
2.1 目標區域測序
目(mu)(mu)前(qian)常用(yong)的(de)是基(ji)因(yin)芯(xin)(xin)片(pian)(pian)(pian)(pian)技術。其測(ce)(ce)序(xu)(xu)原理(li)是基(ji)于(yu) DNA 雜(za)交原理(li)，利(li)用(yong)目(mu)(mu)標(biao)(biao)基(ji)因(yin)組(zu)(zu)區(qu)(qu)域(yu)定(ding)制的(de)探(tan)針(zhen)與(yu)基(ji)因(yin)組(zu)(zu) DNA 進(jin)行芯(xin)(xin)片(pian)(pian)(pian)(pian)雜(za)交或(huo)溶液雜(za)交，將(jiang)目(mu)(mu)標(biao)(biao)基(ji)因(yin)區(qu)(qu)域(yu) DNA 富集，再(zai)通(tong)過(guo)(guo)NGS 技術進(jin)行測(ce)(ce)序(xu)(xu)。其測(ce)(ce)序(xu)(xu)過(guo)(guo)程是通(tong)過(guo)(guo)把數(shu)以萬計(ji)的(de) cDNA 或(huo)寡(gua)聚核苷(gan)酸(suan)置于(yu)芯(xin)(xin)片(pian)(pian)(pian)(pian)上制成(cheng)(cheng)列(lie)(lie)陣，將(jiang)芯(xin)(xin)片(pian)(pian)(pian)(pian)上固(gu)定(ding)好(hao)的(de)已知序(xu)(xu)列(lie)(lie)的(de)核苷(gan)酸(suan)探(tan)針(zhen)與(yu)溶液中含(han)有熒(ying)光標(biao)(biao)記的(de)相應核酸(suan)序(xu)(xu)列(lie)(lie)進(jin)行互(hu)補配對，根據(ju)測(ce)(ce)序(xu)(xu)儀所顯示(shi)強熒(ying)光的(de)位置和(he)強度，獲取(qu)每(mei)組(zu)(zu)點陣列(lie)(lie)信息，再(zai)利(li)用(yong)生物信息學算(suan)法確定(ding)目(mu)(mu)的(de)靶核苷(gan)酸(suan)的(de)序(xu)(xu)列(lie)(lie)組(zu)(zu)成(cheng)(cheng)。測(ce)(ce)序(xu)(xu)所選定(ding)的(de)目(mu)(mu)標(biao)(biao)區(qu)(qu)域(yu)可以是連續的(de) DNA 序(xu)(xu)列(lie)(lie)，也可以是分布在(zai)(zai)同(tong)(tong)一(yi)(yi)個染(ran)色(se)體不(bu)同(tong)(tong)區(qu)(qu)域(yu)或(huo)不(bu)同(tong)(tong)染(ran)色(se)體上的(de)片(pian)(pian)(pian)(pian)段(duan)。目(mu)(mu)標(biao)(biao)區(qu)(qu)域(yu)測(ce)(ce)序(xu)(xu)技術，對于(yu)以往通(tong)過(guo)(guo)連鎖(suo)分析將(jiang)基(ji)因(yin)突變鎖(suo)定(ding)在(zai)(zai)染(ran)色(se)體某一(yi)(yi)片(pian)(pian)(pian)(pian)段(duan)區(qu)(qu)域(yu)內，但無(wu)法找出突變是一(yi)(yi)個非常好(hao)的(de)進(jin)一(yi)(yi)步檢測(ce)(ce)手段(duan)。2010 年，Nicholas等使(shi)用(yong)基(ji)因(yin)分型芯(xin)(xin)片(pian)(pian)(pian)(pian)聯合連鎖(suo)分析技術，成(cheng)(cheng)功發現(xian)(xian)頭小(xiao)畸(ji)形的(de)新(xin)基(ji)因(yin) WDR62，文章發表在(zai)(zai)《NatGenet》雜(za)志。類似(si)的(de)研究在(zai)(zai)家族(zu)性胰腺(xian)癌(ai)中確定(ding) 8 個候選變異(yi)位點和(he)在(zai)(zai)家族(zu)性滲出性玻璃體視網膜病變發現(xian)(xian)易感基(ji)因(yin) TSPAN12。
基(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)(yin)芯(xin)片測(ce)(ce)序(xu)技(ji)術可(ke)(ke)以(yi)將經(jing)過連鎖分(fen)(fen)析鎖定了(le)目標范(fan)圍或(huo)(huo)經(jing)過全基(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)(yin)組篩選的(de)特定基(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)(yin)或(huo)(huo)區(qu)域進行(xing)更(geng)深(shen)一層的(de)研究，是(shi)解(jie)決連鎖分(fen)(fen)析無(wu)法(fa)發(fa)現致病基(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)(yin)的(de)有效(xiao)手段(duan)。基(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)(yin)芯(xin)片技(ji)術對于(yu)(yu)已知基(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)(yin)突變的(de)篩查具有明顯優(you)勢，可(ke)(ke)以(yi)快(kuai)速(su)、全面(mian)地檢(jian)測(ce)(ce)出目標基(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)(yin)突變。同時(shi)，由(you)(you)于(yu)(yu)目標區(qu)域受到了(le)限制，測(ce)(ce)序(xu)范(fan)圍大幅度(du)減少，測(ce)(ce)序(xu)時(shi)間(jian)和費用(yong)(yong)相應降(jiang)低。但基(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)(yin)芯(xin)片檢(jian)測(ce)(ce)所需要的(de) DNA 的(de)量要大，由(you)(you)于(yu)(yu)已提取(qu)的(de) DNA 存(cun)在降(jiang)解(jie)的(de)風險，用(yong)(yong)于(yu)(yu)基(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)(yin)芯(xin)片研究的(de)血標本最(zui)好是(shi)冰凍(dong)的(de)全血，這樣可(ke)(ke)以(yi)使用(yong)(yong)于(yu)(yu)檢(jian)測(ce)(ce) DNA 的(de)量有充分(fen)(fen)保(bao)證。
2.2 全外顯子組測序 （WES）
外(wai)(wai)顯(xian)(xian)子(zi)(zi)組(zu)(zu)是單(dan)個(ge)個(ge)體的(de)(de)基(ji)(ji)因組(zu)(zu) DNA 上所(suo)有(you)(you)蛋白(bai)質編碼序(xu)列(lie)(lie)的(de)(de)總合(he)。人類(lei)(lei)外(wai)(wai)顯(xian)(xian)子(zi)(zi)組(zu)(zu)序(xu)列(lie)(lie)約占人類(lei)(lei)全部基(ji)(ji)因組(zu)(zu)序(xu)列(lie)(lie)的(de)(de) 1%，但大約包含 85% 的(de)(de)致(zhi)病突(tu)變。WES 是利用序(xu)列(lie)(lie)捕(bu)獲技(ji)術(shu)將(jiang)全外(wai)(wai)顯(xian)(xian)子(zi)(zi)區(qu)域 DNA 捕(bu)捉并富集后進(jin)行(xing)高通量測(ce)序(xu)的(de)(de)基(ji)(ji)因分析方法。采用的(de)(de)技(ji)術(shu)平臺主要是羅(luo)氏公司的(de)(de) SeqCap EZ 全外(wai)(wai)顯(xian)(xian)子(zi)(zi)捕(bu)獲系(xi)統(tong)，Illumina 公司的(de)(de) Solexa 技(ji)術(shu)和 Agilent 公司的(de)(de) SureSelect 外(wai)(wai)顯(xian)(xian)子(zi)(zi)靶向序(xu)列(lie)(lie)富集系(xi)統(tong)。其捕(bu)獲的(de)(de)目標(biao)區(qu)在 34 ~ 62 M 之(zhi)間(jian)，不(bu)僅(jin)包括(kuo)編碼區(qu)同(tong)(tong)時也加入了部分非編碼區(qu)。NGS 的(de)(de)測(ce)序(xu)過程(cheng)主要包括(kuo)DNA 測(ce)序(xu)文庫(ku)的(de)(de)制(zhi)備、錨定(ding)橋(qiao)接、PCR 擴增、單(dan)堿基(ji)(ji)延伸測(ce)序(xu)和數(shu)(shu)據分析。研究者根據測(ce)序(xu)儀捕(bu)獲到在測(ce)序(xu)過程(cheng)中摻入有(you)(you)不(bu)同(tong)(tong)熒光標(biao)記堿基(ji)(ji)片段(duan)，經計(ji)算(suan)機將(jiang)熒光信(xin)號轉化(hua)成(cheng)不(bu)同(tong)(tong)顏色的(de)(de)測(ce)序(xu)峰(feng)圖和堿基(ji)(ji)序(xu)列(lie)(lie)。基(ji)(ji)因測(ce)序(xu)結果與NCBI的(de)(de)SNP數(shu)(shu)據庫(ku)、千人基(ji)(ji)因組(zu)(zu)數(shu)(shu)據庫(ku)等國(guo)際權威數(shu)(shu)據庫(ku)比對，最終確定(ding)是否為(wei)突(tu)變基(ji)(ji)因。
自(zi)NGS 技術問世以來，利(li)用 WES 在(zai)(zai)臨床疾病(bing)致(zhi)病(bing)基(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)的(de)鑒定研究中取得前所(suo)未(wei)有的(de)成果(guo)(guo)。這些成果(guo)(guo)不僅集中在(zai)(zai)單(dan)基(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)遺(yi)(yi)傳(chuan)疾病(bing)，還在(zai)(zai)多基(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)影響的(de)復雜疾病(bing)中獲得大(da)量相關(guan)基(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)的(de)發(fa)現。在(zai)(zai)單(dan)基(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)遺(yi)(yi)傳(chuan)性疾病(bing)中，如視網膜色素變性、終端骨發(fa)育(yu)不良等發(fa)現新(xin)(xin)(xin)基(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)或(huo)已知基(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)新(xin)(xin)(xin)突(tu)變。在(zai)(zai)一些罕見(jian)的(de)疾病(bing)中，如 Kabuki 綜合征、家(jia)族性混合型(xing)低脂血癥和脊髓小(xiao)腦共濟失調癥等疾病(bing)中發(fa)現新(xin)(xin)(xin)的(de)致(zhi)病(bing)基(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)。同時(shi)，在(zai)(zai)小(xiao)細(xi)胞肺癌、慢性淋巴細(xi)胞性白血病(bing)等腫瘤(liu)研究和諸如肥胖癥、腦皮質發(fa)育(yu)不良等復雜疾病(bing)的(de)研究中也取得豐(feng)碩成果(guo)(guo)。
WES 技術在篩(shai)查(cha)范(fan)圍和(he)檢出率(lv)等(deng)方(fang)面較(jiao)其(qi)他測(ce)序(xu)(xu)(xu)技術具有(you)(you)明顯(xian)的(de)(de)(de)(de)(de)優勢。例如，對于(yu)采(cai)用(yong) Sanger測(ce)序(xu)(xu)(xu)和(he)基(ji)(ji)因(yin)芯片測(ce)序(xu)(xu)(xu)不(bu)(bu)能篩(shai)查(cha)出基(ji)(ji)因(yin)的(de)(de)(de)(de)(de)樣本，可以(yi)采(cai)用(yong) WES 來進一步基(ji)(ji)因(yin)篩(shai)查(cha)鑒定。應(ying)用(yong) WES技術能夠(gou)獲得較(jiao)傳(chuan)統(tong) Sanger 等(deng)方(fang)法(fa)對編(bian)碼區測(ce)序(xu)(xu)(xu)更深的(de)(de)(de)(de)(de)覆蓋度(du)和(he)更準確的(de)(de)(de)(de)(de)數據。由于(yu)信(xin)息量的(de)(de)(de)(de)(de)大(da)幅度(du)增加，WES 可以(yi)獲得更多(duo)個(ge)體的(de)(de)(de)(de)(de)編(bian)碼區信(xin)息，因(yin)此成為(wei)檢測(ce)致(zhi)病(bing)基(ji)(ji)因(yin)和(he)易感基(ji)(ji)因(yin)位點的(de)(de)(de)(de)(de)有(you)(you)效手(shou)段。與連鎖(suo)分析(xi)定位方(fang)法(fa)比較(jiao)，WES 對家(jia)(jia)系(xi)(xi)的(de)(de)(de)(de)(de)要求(qiu)并不(bu)(bu)十分嚴格，在單基(ji)(ji)因(yin)遺(yi)(yi)(yi)傳(chuan)病(bing)同一家(jia)(jia)系(xi)(xi)中(zhong)有(you)(you) 2 ~3 個(ge)患者和(he) 1 個(ge)正(zheng)常人即可進行致(zhi)病(bing)基(ji)(ji)因(yin)的(de)(de)(de)(de)(de)鑒定研(yan)(yan)(yan)究，而不(bu)(bu)需要連續(xu)三(san)代的(de)(de)(de)(de)(de)遺(yi)(yi)(yi)傳(chuan)家(jia)(jia)系(xi)(xi)。由于(yu)不(bu)(bu)需要嚴格的(de)(de)(de)(de)(de)三(san)代以(yi)上的(de)(de)(de)(de)(de)遺(yi)(yi)(yi)傳(chuan)家(jia)(jia)系(xi)(xi)，WES 使以(yi)前不(bu)(bu)能進行研(yan)(yan)(yan)究的(de)(de)(de)(de)(de)家(jia)(jia)系(xi)(xi)成為(wei)可能。不(bu)(bu)僅對于(yu)單基(ji)(ji)因(yin)遺(yi)(yi)(yi)傳(chuan)病(bing)是一個(ge)很好的(de)(de)(de)(de)(de)研(yan)(yan)(yan)究手(shou)段，對于(yu)許多(duo)常見病(bing)，如腫瘤、糖(tang)尿病(bing)等(deng)疾病(bing)也可進行大(da)規模比較(jiao)研(yan)(yan)(yan)究。
2.3 全基因組重測序 （WGS）
WGS 是對已知基因組序列的物種進行不同個體的全基因組的測序，經過數據分析后對序列進行拼接、組裝并獲得基因組圖譜，或是對不同組織進行測序并分析體細胞突變的一種研究方法。盡管 WES 可以快速全面地找出個體基因組上的所有突變，從而找到個體間的差異，但對于外顯子以外的區域則不能有效地進行基因檢測。對于此種情況，目前還要借助WGS 進行全基因組檢測。但由于人類基因組過于龐大，一次單端全基因組測序很難達到所需要的測序深度。因此，需要重復測序或雙端測序，由此帶來測序成本的大幅度提高和由于不能達到足夠的測序深度所導致的結果準確性的降低。而對于臨床疾病診斷和普通科研工作，其高昂的檢測費用也是難以承受的。盡管如此，對于部分臨床研究和 WES 不能解決的科研課題還需要借助 WGS進行更加全面的基因檢測。
