【基(ji)因(yin)測(ce)(ce)序是什么(me)】基(ji)因(yin)測(ce)(ce)序有什么(me)用(yong) 基(ji)因(yin)測(ce)(ce)序原理技術
隨著基因測(ce)序(xu)技(ji)術的(de)(de)發(fa)展和費用(yong)的(de)(de)降低，現在(zai)普通(tong)人也可以(yi)在(zai)可承受的(de)(de)經濟范圍內進(jin)行個(ge)體測(ce)序(xu)分析，測(ce)序(xu)技(ji)術成為(wei)精(jing)準醫學發(fa)展和個(ge)體化治(zhi)療中(zhong)一(yi)個(ge)非常重要的(de)(de)工(gong)具，我(wo)們即(ji)將(jiang)迎來一(yi)個(ge)全民測(ce)序(xu)的(de)(de)時代。而這(zhe)樣一(yi)種強大的(de)(de)工(gong)具在(zai)科學家們的(de)(de)手中(zhong)又(you)可以(yi)發(fa)揮(hui)出更大價值(zhi)，挖掘(jue)出更有深度的(de)(de)信(xin)息。基因測(ce)序(xu)技(ji)術在(zai)精(jing)準醫學中(zhong)得(de)到(dao)了哪些(xie)應用(yong)呢(ni)？小(xiao)編從以(yi)下幾(ji)個(ge)方(fang)面(mian)結合(he)已發(fa)表(biao)文章進(jin)行了總結。
基因測序助力癌癥研究尋找治療靶點
在(zai)2016年4月8日(ri)那(nei)期(qi)Science期(qi)刊上，美國(guo)布羅德研究所Aviv Regev的(de)(de)領導的(de)(de)癌(ai)癥研究團隊通(tong)過(guo)與麻省理工學院副教(jiao)授、單(dan)細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)分(fen)析(xi)(xi)先鋒Alex Shalek合(he)作，利用單(dan)細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)RNA-seq方(fang)法每(mei)次一個細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)地(di)研究整(zheng)個腫(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)瘤(liu)(liu)以便確定哪些類(lei)型(xing)的(de)(de)細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)存(cun)(cun)在(zai)于腫(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)瘤(liu)(liu)中。他們(men)不(bu)(bu)僅分(fen)析(xi)(xi)了(le)惡性腫(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)瘤(liu)(liu)細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)，而且也(ye)分(fen)析(xi)(xi)了(le)腫(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)瘤(liu)(liu)內所有(you)不(bu)(bu)同類(lei)型(xing)的(de)(de)細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)。這是(shi)首次開展(zhan)這樣(yang)的(de)(de)研究。如今，他們(men)知(zhi)道每(mei)種腫(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)瘤(liu)(liu)的(de)(de)細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)組成，也(ye)知(zhi)道每(mei)種類(lei)型(xing)的(de)(de)細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)的(de)(de)基因(yin)(yin)表達模式，這樣(yang)就(jiu)能夠回(hui)個頭去(qu)重新分(fen)析(xi)(xi)一些大體(ti)積腫(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)瘤(liu)(liu)測序(xu)數(shu)(shu)據(ju)（比如，癌(ai)癥基因(yin)(yin)組圖譜）以便從現(xian)存(cun)(cun)的(de)(de)數(shu)(shu)據(ju)中找出(chu)細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)如何(he)相(xiang)互作用和一定程度(du)上利用細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)重建大塊腫(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)瘤(liu)(liu)樣(yang)品的(de)(de)整(zheng)體(ti)行為(wei)。
在一篇發(fa)表在國際學術期刊Nature Communication上(shang)的文(wen)章中，來自(zi)美(mei)國的科學家們對109名胰腺導管腺癌（PDA）病人進(jin)行了(le)(le)全(quan)外顯子測序，發(fa)現(xian)(xian)了(le)(le)PDA中的基因突(tu)變多樣性(xing)，并(bing)且為發(fa)現(xian)(xian)PDA治療(liao)靶點提供了(le)(le)重要信息。
在(zai)該項(xiang)研究(jiu)中，研究(jiu)人員為方(fang)便(bian)檢(jian)測(ce)基因突變，同(tong)時移(yi)(yi)除(chu)非腫瘤性組織的(de)污(wu)染(ran)，他們利用顯(xian)微切割的(de)方(fang)法將癌癥患者的(de)腫瘤組織進(jin)行(xing)了(le)(le)異種移(yi)(yi)植并(bing)建立了(le)(le)細胞系。隨后對(dui)109例(li)進(jin)行(xing)過(guo)顯(xian)微切割的(de)PDA病例(li)進(jin)行(xing)了(le)(le)全外顯(xian)子(zi)測(ce)序，經(jing)過(guo)顯(xian)微切割操作后，腫瘤細胞得到富集并(bing)增強了(le)(le)對(dui)基因突變的(de)檢(jian)測(ce)。研究(jiu)人員通過(guo)分析發現導(dao)致PDA發生的(de)病因事件與腫瘤突變譜具(ju)有明顯(xian)相(xiang)關(guan)性。
基因測序幫助尋找生物標記物 助力疾病診斷
在歐洲泌尿外科協會的(de)(de)(de)研(yan)(yan)究(jiu)(jiu)者公布(bu)的(de)(de)(de)一(yi)(yi)項最新研(yan)(yan)究(jiu)(jiu)成果中(zhong)，研(yan)(yan)究(jiu)(jiu)者對64份前列腺組織(zhi)樣本進行(xing)研(yan)(yan)究(jiu)(jiu)，對每一(yi)(yi)種(zhong)樣本中(zhong)的(de)(de)(de)2億個(ge)序列進行(xing)閱(yue)讀分析，結果研(yan)(yan)究(jiu)(jiu)者發現(xian)在腫(zhong)瘤(liu)和控制樣本中(zhong)有超過2000個(ge)基因都表現(xian)出了明顯的(de)(de)(de)差(cha)異(yi)性(xing)，其中(zhong)有些(xie)相比(bi)已知(zhi)的(de)(de)(de)前列腺癌標志物(wu)而言(yan)表現(xian)出了較高的(de)(de)(de)特異(yi)性(xing)和敏(min)感(gan)性(xing);其中(zhong)一(yi)(yi)種(zhong)名為TAPIR的(de)(de)(de)非編碼RNAs則可(ke)(ke)以有效抑制癌細胞的(de)(de)(de)生(sheng)長，盡管其可(ke)(ke)以轉(zhuan)化為臨床有用(yong)的(de)(de)(de)治(zhi)療靶點還為時尚早。
研究(jiu)者(zhe)在前(qian)列腺(xian)(xian)癌患者(zhe)的(de)(de)尿液中(zhong)發(fa)(fa)現了這(zhe)些生(sheng)物標志(zhi)物，檢測(ce)結(jie)果顯示其可以幫助進行準確的(de)(de)前(qian)列腺(xian)(xian)癌檢測(ce)，基于(yu)(yu)相(xiang)關研究(jiu)結(jie)果，研究(jiu)人員決定(ding)開發(fa)(fa)一種進行前(qian)列腺(xian)(xian)癌早期診斷的(de)(de)高(gao)特異(yi)性及(ji)敏(min)感性的(de)(de)，且基于(yu)(yu)尿液的(de)(de)檢測(ce)手(shou)段;這(zhe)種檢測(ce)方(fang)法基于(yu)(yu)對多個生(sheng)物標志(zhi)物的(de)(de)組合(he)，相(xiang)比(bi)單一標志(zhi)物而言將表現出較(jiao)高(gao)的(de)(de)特異(yi)性。
基因測序幫助監測全球性疾病暴發
在一篇發表于Nature雜志上(shang)的報道中，來(lai)自(zi)伯明翰大學的研究(jiu)人員解(jie)釋了(le)如何(he)利用基(ji)因(yin)(yin)組測(ce)序(xu)的技術來(lai)快速實現對(dui)疾病暴發的有效監測(ce);文章中他們開發了(le)一種手提箱式的基(ji)因(yin)(yin)組測(ce)序(xu)“實驗(yan)室”，其中包含有一種新(xin)型的DNA測(ce)序(xu)儀，最初該設備用于2015年4月在幾內亞對(dui)埃博(bo)拉(la)病人的樣本進行(xing)檢測(ce)。
這(zhe)(zhe)(zhe)項(xiang)研(yan)究中，研(yan)究人員(yuan)利用(yong)(yong)這(zhe)(zhe)(zhe)種(zhong)便(bian)攜式(shi)的(de)(de)DNA測序儀在整(zheng)個基(ji)因組(zu)庫中鑒別(bie)出了新型(xing)的(de)(de)單核(he)苷(gan)酸多態性（SNPs），目(mu)前(qian)當測序工作(zuo)局限于實驗室的(de)(de)時候，這(zhe)(zhe)(zhe)種(zhong)便(bian)攜式(shi)機器(qi)(qi)的(de)(de)開(kai)發(fa)對于有效進行(xing)疾病暴(bao)發(fa)的(de)(de)監測而言(yan)非常重要，研(yan)究者(zhe)們還希(xi)望可(ke)以將這(zhe)(zhe)(zhe)種(zhong)便(bian)攜式(shi)的(de)(de)機器(qi)(qi)應(ying)用(yong)(yong)于別(bie)的(de)(de)領域的(de)(de)研(yan)究中，比如癌癥研(yan)究等。
在(zai)另(ling)外(wai)一項研究(jiu)中，來(lai)自(zi)英(ying)國牛津大學和巴西(xi)Evandro Chagas研究(jiu)所等(deng)機(ji)構的研究(jiu)人員對巴西(xi)的寨卡(ka)病(bing)毒暴發進(jin)行(xing)首個基因組分析，從而提供關(guan)于這種病(bing)毒如何和何時可能進(jin)入美(mei)洲方面(mian)的新信息。
研究人員對7株巴西寨卡病毒毒株的基因組進行測序，包括一株毒株來自一例致命的成年人病例和另一株毒株來自一名頭小畸型新生兒。
1、第一代測序
1.1 Sanger 測序
采用的(de)是(shi)直接測序(xu)(xu)法。1977年(nian)(nian)，Frederick Sanger 等發(fa)明(ming)(ming)了雙(shuang)脫氧(yang)鏈(lian)末端終止(zhi)法，這一技術隨后成(cheng)(cheng)為最為常用的(de)基(ji)因測序(xu)(xu)技術。2001 年(nian)(nian)，Allan Maxam 和(he) Walter Gibert 發(fa) 明(ming)(ming)了 Sanger 測序(xu)(xu)法，并在此后的(de) 10 年(nian)(nian)里成(cheng)(cheng)為基(ji)因檢(jian)測的(de)金標準。其基(ji)本原理即雙(shuang)脫氧(yang)核(he)苷三磷酸（dideoxyribonucleoside triphosphate，ddNTP）缺乏(fa)PCR 延伸(shen)所需(xu)的(de) 3'-OH，因此每當 DNA 鏈(lian)加入分子 ddNTP，延伸(shen)便終止(zhi)。每一次 DNA 測序(xu)(xu)是(shi)由 4個獨(du)立的(de)反應組(zu)成(cheng)(cheng)，將模板、引物(wu)和(he) 4 種含(han)有(you)不(bu)同的(de)放(fang)射(she)性(xing)同位素標記的(de)核(he)苷酸的(de) ddNTP 分別與DNA 聚合酶混合形成(cheng)(cheng)長短(duan)不(bu)一的(de)片段(duan)，大量起始點(dian)相同、終止(zhi)點(dian)不(bu)同的(de) DNA 片段(duan)存在于反應體系中(zhong)，具有(you)單個堿(jian)基(ji)差別的(de) DNA 序(xu)(xu)列可以被(bei)聚丙烯(xi)酰(xian)胺變(bian)性(xing)凝膠電(dian)泳(yong)分離出來，得到放(fang)射(she)性(xing)同位素自顯影條帶(dai)。依據電(dian)泳(yong)條帶(dai)讀取(qu) DNA 雙(shuang)鏈(lian)的(de)堿(jian)基(ji)序(xu)(xu)列。
人類基(ji)因(yin)組的(de)(de)(de)測序正是基(ji)于該技術完成的(de)(de)(de)。Sanger 測序這(zhe)種直(zhi)(zhi)(zhi)接測序方法具有高(gao)度的(de)(de)(de)準(zhun)確性和簡單、快捷(jie)等特點(dian)。目前，依然對(dui)于一(yi)些臨(lin)床上小(xiao)樣本遺傳疾(ji)病(bing)基(ji)因(yin)的(de)(de)(de)鑒定具有很高(gao)的(de)(de)(de)實(shi)用價(jia)值。例如，臨(lin)床上采用 Sanger 直(zhi)(zhi)(zhi)接測序 FGFR 2 基(ji)因(yin)證實(shi)單基(ji)因(yin) Apert 綜(zong)合征和直(zhi)(zhi)(zhi)接測序 TCOF1 基(ji)因(yin)可以檢出多達 90% 的(de)(de)(de)與 Treacher Collins 綜(zong)合征相(xiang)關的(de)(de)(de)突變。值得注意的(de)(de)(de)是，Sanger 測序是針對(dui)已知致病(bing)基(ji)因(yin)的(de)(de)(de)突變位(wei)點(dian)設計引物，進行 PCR 直(zhi)(zhi)(zhi)接擴(kuo)(kuo)(kuo)增測序。單個突變點(dian)的(de)(de)(de)擴(kuo)(kuo)(kuo)增包括(kuo)該位(wei)點(dian)在(zai)內的(de)(de)(de)外(wai)顯子(zi)片段即可，不(bu)必(bi)將該點(dian)所在(zai)基(ji)因(yin)的(de)(de)(de)全部(bu)外(wai)顯子(zi)都擴(kuo)(kuo)(kuo)增。
因(yin)此(ci)，應明確定位(wei)(wei)要擴增的(de)(de)(de)(de)(de)(de)位(wei)(wei)點所在的(de)(de)(de)(de)(de)(de)基(ji)(ji)因(yin)外(wai)顯(xian)子和(he)(he)該(gai)點的(de)(de)(de)(de)(de)(de)具體(ti)位(wei)(wei)置，設(she)計(ji)包括該(gai)點在內(nei)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)上下(xia)游 150 ~ 200 bp 的(de)(de)(de)(de)(de)(de)外(wai)顯(xian)子片段引物(wu)。此(ci)外(wai)，盡(jin)管有NGS 的(de)(de)(de)(de)(de)(de)出現，但 Sanger 測序對于(yu)有致病(bing)基(ji)(ji)因(yin)位(wei)(wei)點明確并且數(shu)量(liang)有限的(de)(de)(de)(de)(de)(de)單基(ji)(ji)因(yin)遺傳疾病(bing)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)致病(bing)基(ji)(ji)因(yin)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)檢(jian)測是(shi)非常(chang)經濟和(he)(he)高效(xiao)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)。到目前為止，Sanger 測序仍然(ran)是(shi)作為基(ji)(ji)因(yin)檢(jian)測的(de)(de)(de)(de)(de)(de)金標(biao)準，也是(shi) NGS 基(ji)(ji)因(yin)檢(jian)測后進行家系內(nei)和(he)(he)正常(chang)對照組驗證(zheng)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)主要手段。
值得(de)注意的(de)(de)是，Sanger 測(ce)(ce)序(xu)目的(de)(de)是尋找與(yu)疾病有(you)關(guan)的(de)(de)特定的(de)(de)基(ji)因(yin)突變(bian)。對于(yu)沒(mei)有(you)明(ming)確(que)候選基(ji)因(yin)或候選基(ji)因(yin)數量(liang)較(jiao)多的(de)(de)大(da)樣本病例篩查是難(nan)以完成的(de)(de)，此(ci)(ci)類測(ce)(ce)序(xu)研(yan)究還要依(yi)靠具有(you)高通量(liang)測(ce)(ce)序(xu)能(neng)力(li)的(de)(de) NGS。雖然 Sanger 測(ce)(ce)序(xu)具有(you)高度的(de)(de)分析準確(que)性，但其準確(que)性還取決于(yu)測(ce)(ce)序(xu)儀器以及測(ce)(ce)序(xu)條件的(de)(de)設定。另(ling)外，Sanger 測(ce)(ce)序(xu)不能(neng)檢測(ce)(ce)出大(da)片(pian)段缺(que)失或拷貝數變(bian)異等基(ji)因(yin)突變(bian)的(de)(de)類型，因(yin)此(ci)(ci)對于(yu)一(yi)些(xie)與(yu)此(ci)(ci)相關(guan)的(de)(de)遺(yi)傳性疾病還不能(neng)做出基(ji)因(yin)學診斷。
1.2 連鎖分析
采用(yong)的(de)(de)(de)是(shi)(shi)(shi)間(jian)(jian)(jian)接測序(xu)(xu)法(fa)(fa)。在(zai)(zai) NGS 出(chu)現(xian)之前，國際通用(yong)的(de)(de)(de)疾病(bing)基(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)定(ding)位(wei)克(ke)(ke)(ke)隆策略是(shi)(shi)(shi)建立(li)在(zai)(zai)大(da)規(gui)模全基(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)掃描和連(lian)鎖(suo)分(fen)析基(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)礎上的(de)(de)(de)位(wei)置候(hou)選(xuan)基(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)克(ke)(ke)(ke)隆。人(ren)類的(de)(de)(de)染(ran)色體成對(dui)出(chu)現(xian)，一(yi)(yi)條(tiao)來(lai)自父親，一(yi)(yi)條(tiao)來(lai)自母親，每(mei)一(yi)(yi)對(dui)染(ran)色體在(zai)(zai)同樣的(de)(de)(de)位(wei)置上擁有(you)相同的(de)(de)(de)基(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)，但是(shi)(shi)(shi)其序(xu)(xu)列(lie)并(bing)不完全相同，被稱(cheng)為父系和母系等位(wei)基(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)。遺傳(chuan)標(biao)(biao)記(ji)(ji)是(shi)(shi)(shi)指(zhi)在(zai)(zai)人(ren)群中(zhong)表(biao)(biao)現(xian)出(chu)多(duo)態現(xian)象的(de)(de)(de) DNA 序(xu)(xu)列(lie)，可(ke)(ke)(ke)追(zhui)蹤染(ran)色體、染(ran)色體某(mou)一(yi)(yi)節段或某(mou)個(ge)基(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)座在(zai)(zai)家系中(zhong)傳(chuan)遞的(de)(de)(de)任何一(yi)(yi)種(zhong)遺傳(chuan)特性(xing)。它存(cun)在(zai)(zai)于每(mei)一(yi)(yi)個(ge)人(ren)，但大(da)小和序(xu)(xu)列(lie)有(you)差別(bie)(bie)，具有(you)可(ke)(ke)(ke)遺傳(chuan)性(xing)和可(ke)(ke)(ke)識別(bie)(bie)性(xing)。目前采用(yong)第二代(dai)遺傳(chuan)標(biao)(biao)記(ji)(ji)，即重復序(xu)(xu)列(lie)多(duo)態性(xing)，特別(bie)(bie)是(shi)(shi)(shi)短串聯重復序(xu)(xu)列(lie)，又稱(cheng)微衛星標(biao)(biao)記(ji)(ji)。連(lian)鎖(suo)分(fen)析是(shi)(shi)(shi)以連(lian)鎖(suo)這種(zhong)遺傳(chuan)現(xian)象為基(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)礎，研(yan)究致(zhi)病(bing)基(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)與(yu)遺傳(chuan)性(xing)標(biao)(biao)記(ji)(ji)之間(jian)(jian)(jian)關系的(de)(de)(de)方(fang)法(fa)(fa)。如果控制某(mou)一(yi)(yi)表(biao)(biao)型性(xing)狀的(de)(de)(de)基(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)附(fu)近(jin)存(cun)在(zai)(zai)遺傳(chuan)標(biao)(biao)記(ji)(ji)，那么利(li)用(yong)某(mou)個(ge)遺傳(chuan)標(biao)(biao)記(ji)(ji)與(yu)某(mou)個(ge)擬定(ding)位(wei)的(de)(de)(de)基(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)之間(jian)(jian)(jian)是(shi)(shi)(shi)否(fou)存(cun)在(zai)(zai)連(lian)鎖(suo)關系，以及(ji)連(lian)鎖(suo)的(de)(de)(de)緊密(mi)程度就能(neng)將(jiang)該(gai)基(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)定(ding)位(wei)到(dao)染(ran)色體某(mou)一(yi)(yi)位(wei)置上。1986 年 Morton 等提出(chu)優(you)勢對(dui)數記(ji)(ji)分(fen)法(fa)(fa)（og odds score method，LOD），主要檢(jian)測兩基(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)以某(mou)一(yi)(yi)重組率連(lian)鎖(suo)時(shi)的(de)(de)(de)似然性(xing)。LOD 值(zhi)為正，支持連(lian)鎖(suo)；LOD 值(zhi)為負，則否(fou)定(ding)連(lian)鎖(suo)。通過計算(suan)(suan)家系中(zhong)的(de)(de)(de)微衛星標(biao)(biao)記(ji)(ji)與(yu)致(zhi)病(bing)位(wei)點之間(jian)(jian)(jian)的(de)(de)(de) LOD 值(zhi)，可(ke)(ke)(ke)以初步(bu)估算(suan)(suan)二者間(jian)(jian)(jian)的(de)(de)(de)遺傳(chuan)距(ju)離及(ji)連(lian)鎖(suo)程度，從而確定(ding)該(gai)基(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)在(zai)(zai)染(ran)色體上的(de)(de)(de)粗(cu)略位(wei)置。然后利(li)用(yong)該(gai)區域的(de)(de)(de)染(ran)色體基(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)圖(tu)譜，分(fen)析定(ding)位(wei)區域內所(suo)有(you)基(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)的(de)(de)(de)功能(neng)與(yu)表(biao)(biao)達，選(xuan)擇合適(shi)的(de)(de)(de)候(hou)選(xuan)基(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)進行突變檢(jian)測，最終將(jiang)致(zhi)病(bing)基(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)定(ding)位(wei)或克(ke)(ke)(ke)隆。
然而，采用連鎖(suo)分析進行基因檢測(ce)(ce)存(cun)在(zai)(zai)(zai)很大(da)的(de)(de)局限(xian)性(xing)。不但(dan)所需遺傳(chuan)樣本(ben)量較(jiao)大(da)，一般(ban)要求提供三代及以上遺傳(chuan)家(jia)系患者血樣，而且數據(ju)量大(da)、處理復雜、產出速度較(jiao)慢、定位不夠(gou)精確（一般(ban)只能定位在(zai)(zai)(zai)染色(se)體某一區間(jian)），這(zhe)就(jiu)使(shi)得研(yan)究(jiu)工作繁重(zhong)和定位基因的(de)(de)時間(jian)周期特(te)別長。目前，連鎖(suo)分析采用的(de)(de)單(dan)核(he)苷酸多(duo)肽性(xing)和短串聯重(zhong)復序(xu)列還(huan)在(zai)(zai)(zai)使(shi)用，但(dan)經典的(de)(de)間(jian)接測(ce)(ce)序(xu)方(fang)法(fa)，如(ru)單(dan)鏈構(gou)象多(duo)肽性(xing)、變性(xing)梯度凝膠電泳(yong)和異源雙(shuang)鏈分析在(zai)(zai)(zai)美國已被(bei)淘汰(tai)，而在(zai)(zai)(zai)發展中國家(jia)作為研(yan)究(jiu)手段還(huan)在(zai)(zai)(zai)有限(xian)使(shi)用。
2、新一代測序（NGS）
主 要 包 括 全 基 因 組 重 測 序(xu)（whole-genomesequencing，WGS）、全外顯子組測序(xu)（whole-exomesequencing，WES）和(he)目標區域測序(xu)（Targeted regionssequencing，TRS），它(ta)們同(tong)屬于新一代測序(xu)技(ji)術。總體(ti)而言，NGS 技(ji)術具有通量(liang)大(da)、時間短(duan)(duan)、精確(que)度高(gao)和(he)信息量(liang)豐富等優點(dian)，使得遺傳學者可(ke)以在短(duan)(duan)時間內對(dui)感興趣的基因進(jin)行精確(que)定位。但(dan)這(zhe)些不(bu)同(tong)的測序(xu)技(ji)術在測序(xu)范圍、數(shu)據分析量(liang)以及測序(xu)費(fei)用(yong)(yong)和(he)時間等方(fang)面又(you)有很(hen)大(da)差(cha)別(bie)，如(ru)果選(xuan)擇適合的方(fang)法，對(dui)于臨(lin)床診(zhen)斷和(he)科(ke)學研究將(jiang)起到(dao)事半功倍(bei)的作用(yong)(yong)。
2.1 目標區域測序
目(mu)前常(chang)用(yong)的(de)(de)是基(ji)(ji)(ji)因(yin)芯(xin)(xin)(xin)片(pian)(pian)技術(shu)。其(qi)測(ce)(ce)序(xu)原理是基(ji)(ji)(ji)于 DNA 雜交(jiao)原理，利(li)(li)用(yong)目(mu)標(biao)基(ji)(ji)(ji)因(yin)組(zu)區域(yu)定(ding)制的(de)(de)探(tan)針與(yu)基(ji)(ji)(ji)因(yin)組(zu) DNA 進行芯(xin)(xin)(xin)片(pian)(pian)雜交(jiao)或溶液雜交(jiao)，將目(mu)標(biao)基(ji)(ji)(ji)因(yin)區域(yu) DNA 富集，再(zai)通(tong)過(guo)(guo)NGS 技術(shu)進行測(ce)(ce)序(xu)。其(qi)測(ce)(ce)序(xu)過(guo)(guo)程(cheng)是通(tong)過(guo)(guo)把(ba)數以萬計的(de)(de) cDNA 或寡聚(ju)核苷(gan)酸置(zhi)于芯(xin)(xin)(xin)片(pian)(pian)上(shang)制成列陣(zhen)，將芯(xin)(xin)(xin)片(pian)(pian)上(shang)固定(ding)好(hao)的(de)(de)已知序(xu)列的(de)(de)核苷(gan)酸探(tan)針與(yu)溶液中含有熒(ying)(ying)光標(biao)記的(de)(de)相應核酸序(xu)列進行互補配對(dui)，根據(ju)測(ce)(ce)序(xu)儀(yi)所顯示強熒(ying)(ying)光的(de)(de)位置(zhi)和強度，獲(huo)取每(mei)組(zu)點陣(zhen)列信息，再(zai)利(li)(li)用(yong)生物信息學算(suan)法確定(ding)目(mu)的(de)(de)靶(ba)核苷(gan)酸的(de)(de)序(xu)列組(zu)成。測(ce)(ce)序(xu)所選(xuan)定(ding)的(de)(de)目(mu)標(biao)區域(yu)可(ke)以是連(lian)(lian)續(xu)的(de)(de) DNA 序(xu)列，也可(ke)以是分(fen)(fen)布在同(tong)(tong)一個染色體(ti)(ti)不同(tong)(tong)區域(yu)或不同(tong)(tong)染色體(ti)(ti)上(shang)的(de)(de)片(pian)(pian)段。目(mu)標(biao)區域(yu)測(ce)(ce)序(xu)技術(shu)，對(dui)于以往通(tong)過(guo)(guo)連(lian)(lian)鎖分(fen)(fen)析將基(ji)(ji)(ji)因(yin)突變(bian)(bian)(bian)鎖定(ding)在染色體(ti)(ti)某一片(pian)(pian)段區域(yu)內，但無法找出突變(bian)(bian)(bian)是一個非(fei)常(chang)好(hao)的(de)(de)進一步(bu)檢測(ce)(ce)手段。2010 年，Nicholas等使用(yong)基(ji)(ji)(ji)因(yin)分(fen)(fen)型(xing)芯(xin)(xin)(xin)片(pian)(pian)聯合連(lian)(lian)鎖分(fen)(fen)析技術(shu)，成功(gong)發(fa)現頭小畸形的(de)(de)新基(ji)(ji)(ji)因(yin) WDR62，文章發(fa)表在《NatGenet》雜志。類似(si)的(de)(de)研究在家族性(xing)胰腺癌中確定(ding) 8 個候選(xuan)變(bian)(bian)(bian)異位點和在家族性(xing)滲出性(xing)玻璃(li)體(ti)(ti)視(shi)網膜病變(bian)(bian)(bian)發(fa)現易感基(ji)(ji)(ji)因(yin) TSPAN12。
基(ji)因(yin)芯(xin)片(pian)(pian)測(ce)序技術可(ke)以將經(jing)(jing)過連鎖分析鎖定了目(mu)(mu)標范圍(wei)或(huo)經(jing)(jing)過全(quan)基(ji)因(yin)組篩選的(de)(de)(de)特定基(ji)因(yin)或(huo)區域進行更深一層的(de)(de)(de)研究，是解(jie)(jie)決連鎖分析無法發(fa)現致病基(ji)因(yin)的(de)(de)(de)有效手(shou)段。基(ji)因(yin)芯(xin)片(pian)(pian)技術對于(yu)(yu)(yu)已知基(ji)因(yin)突變(bian)的(de)(de)(de)篩查具(ju)有明顯優勢(shi)，可(ke)以快速、全(quan)面地(di)檢測(ce)出目(mu)(mu)標基(ji)因(yin)突變(bian)。同時，由(you)于(yu)(yu)(yu)目(mu)(mu)標區域受到了限(xian)制，測(ce)序范圍(wei)大(da)幅度(du)減少，測(ce)序時間和(he)費用(yong)相應(ying)降低。但基(ji)因(yin)芯(xin)片(pian)(pian)檢測(ce)所需要(yao)的(de)(de)(de) DNA 的(de)(de)(de)量(liang)要(yao)大(da)，由(you)于(yu)(yu)(yu)已提取的(de)(de)(de) DNA 存在降解(jie)(jie)的(de)(de)(de)風險，用(yong)于(yu)(yu)(yu)基(ji)因(yin)芯(xin)片(pian)(pian)研究的(de)(de)(de)血標本最好是冰凍(dong)的(de)(de)(de)全(quan)血，這樣可(ke)以使用(yong)于(yu)(yu)(yu)檢測(ce) DNA 的(de)(de)(de)量(liang)有充分保證。
2.2 全外顯子組測序 （WES）
外(wai)顯(xian)子(zi)(zi)組(zu)(zu)是(shi)(shi)(shi)單個個體(ti)的(de)基(ji)因(yin)組(zu)(zu) DNA 上所有蛋(dan)白質編(bian)(bian)碼(ma)序(xu)(xu)列(lie)(lie)的(de)總合。人(ren)類外(wai)顯(xian)子(zi)(zi)組(zu)(zu)序(xu)(xu)列(lie)(lie)約占人(ren)類全部基(ji)因(yin)組(zu)(zu)序(xu)(xu)列(lie)(lie)的(de) 1%，但大約包含 85% 的(de)致(zhi)病突變。WES 是(shi)(shi)(shi)利用(yong)序(xu)(xu)列(lie)(lie)捕(bu)獲(huo)(huo)(huo)技(ji)術將(jiang)全外(wai)顯(xian)子(zi)(zi)區域(yu) DNA 捕(bu)捉并(bing)富集后(hou)進(jin)行高通(tong)量(liang)測(ce)(ce)序(xu)(xu)的(de)基(ji)因(yin)分析(xi)方法(fa)。采用(yong)的(de)技(ji)術平臺主(zhu)要是(shi)(shi)(shi)羅氏公(gong)(gong)(gong)司(si)的(de) SeqCap EZ 全外(wai)顯(xian)子(zi)(zi)捕(bu)獲(huo)(huo)(huo)系統(tong)，Illumina 公(gong)(gong)(gong)司(si)的(de) Solexa 技(ji)術和 Agilent 公(gong)(gong)(gong)司(si)的(de) SureSelect 外(wai)顯(xian)子(zi)(zi)靶向序(xu)(xu)列(lie)(lie)富集系統(tong)。其捕(bu)獲(huo)(huo)(huo)的(de)目標(biao)區在 34 ~ 62 M 之間，不僅包括編(bian)(bian)碼(ma)區同(tong)時(shi)也加入了部分非編(bian)(bian)碼(ma)區。NGS 的(de)測(ce)(ce)序(xu)(xu)過(guo)程主(zhu)要包括DNA 測(ce)(ce)序(xu)(xu)文(wen)庫(ku)的(de)制備(bei)、錨定橋接、PCR 擴(kuo)增、單堿(jian)(jian)基(ji)延伸(shen)測(ce)(ce)序(xu)(xu)和數(shu)(shu)據分析(xi)。研究(jiu)者根據測(ce)(ce)序(xu)(xu)儀(yi)捕(bu)獲(huo)(huo)(huo)到在測(ce)(ce)序(xu)(xu)過(guo)程中摻入有不同(tong)熒光標(biao)記堿(jian)(jian)基(ji)片段，經計(ji)算機將(jiang)熒光信(xin)號轉化成不同(tong)顏色的(de)測(ce)(ce)序(xu)(xu)峰圖和堿(jian)(jian)基(ji)序(xu)(xu)列(lie)(lie)。基(ji)因(yin)測(ce)(ce)序(xu)(xu)結果(guo)與NCBI的(de)SNP數(shu)(shu)據庫(ku)、千人(ren)基(ji)因(yin)組(zu)(zu)數(shu)(shu)據庫(ku)等國際(ji)權威數(shu)(shu)據庫(ku)比對，最終確定是(shi)(shi)(shi)否為突變基(ji)因(yin)。
自(zi)NGS 技術問世以來，利用 WES 在(zai)臨床疾(ji)病(bing)致(zhi)病(bing)基(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)的(de)(de)(de)鑒定研(yan)(yan)究中(zhong)取得前所未(wei)有(you)的(de)(de)(de)成果。這(zhe)些(xie)成果不僅集中(zhong)在(zai)單(dan)基(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)遺傳疾(ji)病(bing)，還在(zai)多(duo)基(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)影響的(de)(de)(de)復雜(za)(za)疾(ji)病(bing)中(zhong)獲得大量(liang)相關基(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)的(de)(de)(de)發(fa)現(xian)。在(zai)單(dan)基(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)遺傳性疾(ji)病(bing)中(zhong)，如視網(wang)膜色素變(bian)性、終(zhong)端骨發(fa)育不良等(deng)(deng)發(fa)現(xian)新基(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)或已知基(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)新突變(bian)。在(zai)一些(xie)罕見(jian)的(de)(de)(de)疾(ji)病(bing)中(zhong)，如 Kabuki 綜合征、家族性混合型(xing)低脂血(xue)癥和脊髓小(xiao)腦共濟失調癥等(deng)(deng)疾(ji)病(bing)中(zhong)發(fa)現(xian)新的(de)(de)(de)致(zhi)病(bing)基(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)。同時，在(zai)小(xiao)細(xi)胞肺癌(ai)、慢性淋巴細(xi)胞性白血(xue)病(bing)等(deng)(deng)腫瘤研(yan)(yan)究和諸如肥胖(pang)癥、腦皮質發(fa)育不良等(deng)(deng)復雜(za)(za)疾(ji)病(bing)的(de)(de)(de)研(yan)(yan)究中(zhong)也取得豐碩成果。
WES 技(ji)術(shu)在篩(shai)查(cha)范圍和(he)檢出(chu)率等(deng)方面較(jiao)其他(ta)測(ce)序(xu)技(ji)術(shu)具有明顯的(de)優勢。例如，對(dui)于(yu)采(cai)用 Sanger測(ce)序(xu)和(he)基(ji)(ji)(ji)因(yin)芯片測(ce)序(xu)不能篩(shai)查(cha)出(chu)基(ji)(ji)(ji)因(yin)的(de)樣本，可(ke)(ke)以(yi)(yi)采(cai)用 WES 來進(jin)一步(bu)基(ji)(ji)(ji)因(yin)篩(shai)查(cha)鑒(jian)定。應(ying)用 WES技(ji)術(shu)能夠獲(huo)得(de)(de)較(jiao)傳(chuan)統(tong) Sanger 等(deng)方法(fa)對(dui)編(bian)碼(ma)區測(ce)序(xu)更深(shen)的(de)覆蓋度(du)和(he)更準確(que)的(de)數據。由(you)(you)于(yu)信息量(liang)的(de)大幅度(du)增加(jia)，WES 可(ke)(ke)以(yi)(yi)獲(huo)得(de)(de)更多個體的(de)編(bian)碼(ma)區信息，因(yin)此成(cheng)為檢測(ce)致病基(ji)(ji)(ji)因(yin)和(he)易感基(ji)(ji)(ji)因(yin)位點的(de)有效手段。與(yu)連鎖分(fen)析定位方法(fa)比較(jiao)，WES 對(dui)家(jia)系(xi)的(de)要(yao)求并不十分(fen)嚴(yan)格(ge)，在單基(ji)(ji)(ji)因(yin)遺傳(chuan)病同(tong)一家(jia)系(xi)中有 2 ~3 個患者和(he) 1 個正(zheng)常人即(ji)可(ke)(ke)進(jin)行致病基(ji)(ji)(ji)因(yin)的(de)鑒(jian)定研究(jiu)，而(er)不需要(yao)連續三代的(de)遺傳(chuan)家(jia)系(xi)。由(you)(you)于(yu)不需要(yao)嚴(yan)格(ge)的(de)三代以(yi)(yi)上的(de)遺傳(chuan)家(jia)系(xi)，WES 使以(yi)(yi)前(qian)不能進(jin)行研究(jiu)的(de)家(jia)系(xi)成(cheng)為可(ke)(ke)能。不僅對(dui)于(yu)單基(ji)(ji)(ji)因(yin)遺傳(chuan)病是一個很(hen)好的(de)研究(jiu)手段，對(dui)于(yu)許多常見病，如腫瘤、糖尿病等(deng)疾病也可(ke)(ke)進(jin)行大規模比較(jiao)研究(jiu)。
2.3 全基因組重測序 （WGS）
WGS 是對已知基因組序列的物種進行不同個體的全基因組的測序，經過數據分析后對序列進行拼接、組裝并獲得基因組圖譜，或是對不同組織進行測序并分析體細胞突變的一種研究方法。盡管 WES 可以快速全面地找出個體基因組上的所有突變，從而找到個體間的差異，但對于外顯子以外的區域則不能有效地進行基因檢測。對于此種情況，目前還要借助WGS 進行全基因組檢測。但由于人類基因組過于龐大，一次單端全基因組測序很難達到所需要的測序深度。因此，需要重復測序或雙端測序，由此帶來測序成本的大幅度提高和由于不能達到足夠的測序深度所導致的結果準確性的降低。而對于臨床疾病診斷和普通科研工作，其高昂的檢測費用也是難以承受的。盡管如此，對于部分臨床研究和 WES 不能解決的科研課題還需要借助 WGS進行更加全面的基因檢測。
